科创中国

目的:探讨低氧条件下丹参酮IIA(Tan IIA)对人肝癌Hep G2细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制.方法:用氯化钴(Co Cl2)创建低氧模型,实验分为常氧对照组、低氧对照组和低氧+Tan IIA处理组.不同浓度的Tan IIA分别作用于低氧下人肝癌Hep G2细胞24 h、48 h和72 h,采用MTT法测定Tan IIA对低氧下Hep G2细胞增殖的抑制作用.不同浓度的Tan IIA分别作用于低氧条件下Hep G2细胞24 h和48 h后,Hoechst 33258染色法检测细胞核的形态学变化并计算凋亡率.不同浓度的Tan IIA作用于低氧条件下人肝癌Hep G2细胞48 h后,Western blotting检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和野生型P53的蛋白表达情况.结果:低氧条件下Tan IIA以时间和剂量依赖方式抑制Hep G2细胞的生长和增殖.Tan IIA作用于低氧下的Hep G2细胞后,可见典型的凋亡细胞形态学特征,细胞凋亡率呈时间、剂量依赖性的增加.Western blotting免疫印迹法显示常氧对照组的HIF-1α和VEGF表达较低,而低氧对照组的HIF-1α、VEGF蛋白表达较常氧组升高,低氧下随着Tan IIA浓度的升高,HIF-1α和VEGF蛋白的表达明显降低,野生型P53蛋白的表达随着Tan IIA浓度的升高而升高.结论:低氧条件下,Tan IIA能抑制肝癌Hep G2细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与抑制HIF-1α和VEGF蛋白表达,上调P53蛋白表达有关.

目的: beclin 1基因慢病毒表达载体稳定感染三阴性乳腺癌BT549细胞后,于短程低氧条件下探讨beclin 1基因对上皮间质转化( EMT)的影响。方法用带有pLenO-GTP Vector及pLenO-GTP-beclin 1 Vector的慢病毒以感染复数( MOI)为20分别感染BT549细胞,即实验对照组及实验组,未感染细胞作为空白对照。感染96 h后用倒置荧光显微镜观察荧光,估计感染效率;用Western blot法检测beclin 1基因是否在 BT549细胞中稳定表达;将各组细胞低氧培养12、24 h 后采用荧光定量 PCR、Western blot法及激光共聚焦显微镜检测EMT相关标志物;用Western blot法检测低氧培养24 h后的各组细胞Wnt/β-catenin信号通路的相关蛋白表达水平。用两样本t检验分析低氧时间对细胞EMT相关标志物的表达情况,余计量资料用方差分析进行统计。结果慢病毒感染BT549细胞96 h后,感染效率约为100%,实验组beclin 1蛋白高效稳定表达(F=107.200,P=0.000);低氧条件下,相对于空白对照组、实验对照组,实验组细胞的上皮标志物E-cadherin mRNA和蛋白表达水平上调(12 h:F=122.451、P=0.000,F=29.651、P=0.001;24 h:F=108.783、P=0.000,F=41.232、P=0.000),而间皮标志物 N-cadherin、vimentin及 fibronectin表达水平下调(12 h:N-cadherin F=92.918、P=0.000、F=138.034、P=0.000,vimentin F=135.313、P=0.000、F=39.765、P=0.000,fibronectin F=144.275、P=0.000;24 h:N-cadherin F=76.064、P=0.000、F=40.614、P=0.000, vimentin F=206.576、P=0.000、F=46.658、P=0.000,fibronectin F=411.405、P=0.000);相对于低氧培养12 h,各组细胞低氧培养24 h后E-cadherin表达水平下调(空白对照组:t=4.266、P=0.013,t=11.235、P=0.000;实验对照组:t=10.463、P=0.000,t=4.092、P=0.009;实验组:t=28.208、P=0.000,t=7.262、P=0.001),而 N-cadherin(实验组除外)、vimentin和fibronectin表达水平上调(空白对照组:N-cadherin t=3.072、P=0.037、t=7.146、P=0.002, vimentin t=6.384、P=0.003、t=7.476、P=0.002,fibronectin t=8.389、P=0.001;实验对照组:N-cadherin t=2.805、P=0.049、t=5.352、P=0.006,vimentin t=12.701、P=0.000、t=5.923、P=0.004,fibronectin t=7.318、P=0.002;实验组:N-cadherin t=7.849、P=0.001、t=1.987、P=0.184,vimentin t=11.097、P=0.000、t=13.626、P=0.000,fibronectin t=11.003、P=0.000);beclin 1基因与低氧环境对 BT549细胞E-cadherin、N-cadherin的表达水平有交互效应( E-cadherin: F=19.175、P=0.000,F=5.588、P=0.015;N-cadherin:F=8.238、P=0.006,F=5.934、P=0.016);低氧培养24 h后,实验组Wnt/β-catenin信号通路的β-catenin、Snail蛋白水平下调(β-catenin: F=18.169, P=0.003;Snail: F=11.098, P=0.010),而p-GSK-3β的蛋白水平上调(F=36.096, P=0.000)。结论 beclin 1基因在短程低氧条件下抑制BT549细胞EMT,而随时间的增加低氧促进 EMT;beclin 1基因在短程低氧环境下抑制 EMT 的机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep apnea syndrome,OSAS)是由于睡眠时上气道阻塞,呼吸时上气道阻力增加,使呼吸变浅变慢或暂停,继而引起反复发作的低氧和高碳酸血症,是多种心血管疾病如高血压、心律失常、心肌缺血和心衰以及心脏猝死的重要危险因素[1-2].它不仅可以引起急性血流动力学改变,长期效应还可引起慢性血流动力学改变及心脏结构和功能变化.大量文献显示间歇性

目的:研究牛磺酸对低氧条件下豚鼠心室肌细胞内向整流钾电流(Ik1)的影响.方法:酶解法分离单个豚鼠心室肌细胞和建立离体低氧模型,采用全细胞膜片钳记录技术记录牛磺酸对急性低氧条件下豚鼠心室肌细胞Ik1的作用.结果:在钳制电压-40 mV下,给予20 mmol/L牛磺酸使Ik1的电流峰值降低,抑制率(45.61±10.70)%;洗脱后,Ik1能够部分恢复(P

低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factors, HIF-1)是介导哺乳动物和人体细胞低氧适应性反应的主要核转录因子,是专一调节氧稳态的关键物质。 HIF-1对胚胎的正常发育,软骨及骨的形成等多种生理过程起保护及促进作用,也与肿瘤、糖尿病及其并发症等多种缺血低氧性疾病密切相关。 HIF-1在这些疾病中的分子机制已成为目前的研究热点,笔者就HIF-1的结构特征、调控机制、生物学效用及在药物研发等方面进行综述。

目的:通过建立肥胖大鼠低氧训练模型,观察血清Visfatin含量和脂肪组织Visfatin基因表达水平,探讨低氧训练对肥胖大鼠Visfatin的影响.方法:单纯性肥胖大鼠建模成功后,筛选130只随机分为13组:对照0周组,低氧安静1、2、3、4周组,常氧训练1、2、3、4周组,低氧训练1、2、3、4周组.低氧环境模拟海拔3 500 m(氧浓度13.6%);常氧和低氧训练组分别以25 m/min、20 m/min进行跑台训练,各训练组持续运动1 h/d、6 d/w、1~4周.采用ELISA法测试血清Visfatin含量,荧光定量PCR法测试附睾脂肪Visfain mRNA相对表达量.结果:1)肥胖大鼠0周时血清Visfatin含量(50.095±9.092 μg/L)显著高于其他各周(P<0.01),常氧训练第1、2、3、4周时分别为17.856±3.596 μg/L、27.002±10.475 μg/L、26.866±7.107μg/L、36.385±5.455 μg/L,低氧安静组第1、2、3、4周时分别为22.382±6.356μg/L、24.662±6.654μg/L、25.764士9.382 μg/L、34.504±6.946 μg/L,低氧训练组第1、2、3、4周时分别为17.227士5.106 μg/L、18.360士5.181 μg/L、15.065±4.466μg/L、16.689±7.728μg/L;常氧训练和低氧安静组,其变化趋势一致,第1周显著性下降(P<0.01),随后回升;而低氧训练组一直保持在低水平,后3周均显著低于其他两组(P<0.01).2)肥胖大鼠0周时脂肪组织Visfatin mRNA相对表达量为0.0658±0.0263,常氧训练组第1、2、3、4周时分别为0.0569±0.0237、0.0499±0.0130、0.0653±0.0288、0.1071±0.0437,第4周时显著高于第1、2、3周时水平(P<0.01);低氧安静组第1、2、3、4周时分别为0.0883±0.0442、0.0990±0.0570、0.0507±0.0178、0.0883±0.0312;低氧训练组第1、2、3、4周时则表现出下降的趋势,分别为0.1102±0.0368、0.0845±0.0238、0.0679±0.0245、0.0668±0.0298,低氧训练第4周时其相对表达量低于常氧训练和低氧安静组,与常氧训练组比较差异显著(P<0.05).结论:1)低氧训练控制肥胖大鼠血清Visfatin水平较常氧训练和低氧安静曼为有效;2)与常氧训练和低氧安静比较,低氧训练下调脂肪组织Visfatin基因表达作用更明显.

目的 以缺氧/再复氧(H/R)和脂多糖(LPS)刺激人结肠上皮细胞株(FHC)模拟体内肠上皮细胞遭受缺血、缺血/再灌注和炎症打击的病理过程,探讨大黄素干预的可能作用靶点.方法 常氧组:在37 ℃下用95%空气和5%CO2培养.缺氧(H)组:于37℃下用1%O2、5%CO2和94%N2的混合厌氧气体使细胞缺氧1、2、3、4h.H+LPS组:在H组基础上给予LPS 1 mg/L刺激.H/R组:于缺氧3h后分别复氧1、2、3、4h.H/R+LPS组:在H/R基础上给予LPS 1 mg/L刺激.大黄素干预组:在H3 h/R2 h+LPS基础上给予20、40、60、80 μmol/L大黄素进行干预.用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测磷酸化核转录因子-κB(NF-κB)抑制蛋白-α(pIκB-α)、磷酸化NF-κBp65(pNF-κBp65)、环氧化酶-2(COX-2)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白表达.相差显微镜下观察各组肠上皮细胞的形态学改变;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测大黄素对肠上皮细胞增殖情况的影响.结果 ①H组:pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2表达量均于H1 h达峰值,分别为0.350±0.018、1.083±0.054、0.903±0.045,然后递减(F值分别为3.011、7.247、5.754,P值分别为0.013、0.000、0.005);HIF-1α在H3 h表达最高(1.511±0.076),但各时间点间比较无差异(F=1.881,P=0.062).H+LPS组:pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α表达量均随缺氧时间延长而增加,H3 h达峰值,分别为0.504±0.025、1.255±0.063、0.812±0.041、1.209±0.075(F值分别为2.683、8.774、9.765、2.432,P值分别为0.011、0.000、0.000、0.026).H/R组:随着再复氧时间延长,pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2表达递减,于H3 h/R4 h降至最低,分别为0.712±0.034、1.202±0.048、0.691±0.042(F值分别为1.923、6.765、2.719,P值分别为0.063、0.000、0.016);与H组相比,H/R组HIF-1α在再复氧过程中表达明显减少,但各时间点间无差异(F=1.280,P=0.081).H/R+LPS组:随着再复氧时间延长,pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α并无降解,于R2~3 h达峰值,分别为3.302±0.061、2.315±0.055、2.017±0.043、2.413±0.098(F值分别为4.614、1.652、5.970、2.076,P值分别为0.001、0.067、0.000、0.037).大黄素共同干预组:大黄素可以抑制NF-κB和HIF-1α通路蛋白表达,存在量效关系(P<0.05或P<0.01).80 μmol/L大黄素可使pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α蛋白表达量降至最低,分别为2.599±0.130、1.772±0.089、2.590±0.129、2.518±0.125;大黄素后处理细胞则无此效果.②经过H/R+LPS处理的细胞内发生空泡样变、形态改变、细胞融合,相比H组生长速度缓慢.③MTT法检测结果显示,20~ 80 μmol/L大黄素对细胞增殖无明显影响,说明大黄素在此浓度范围不仅产生了生物学效应,且对细胞无药物毒性.结论 缺氧或炎症均可激活HIF-1α的缺氧通路和NF-κB的炎症通路,在H/R过程中,这两条通路蛋白随着再复氧时间延长表达降低,但在H/R+LPS过程中蛋白仍相对高表达,缺血/再灌注损伤可能与内毒素共同作用破坏肠上皮细胞,导致肠源性脓毒症的发生.在炎症早期阶段而非晚期阶段,用大黄素可以阻断NF-κB/HIF-1 α-COX-2信号通路,从而发挥抗炎作用.

目的 探讨二十味沉香丸对低压低氧暴露大鼠血红蛋白(Hb)、红细胞比容(Hct)及血清促红细胞生成素(EPO)表达的影响.方法 将165只Wistar大鼠随机分为平原对照组(15只)、高原对照组(75只)和高原给药组(75只).平原对照组即刻检测Hb、Hct,采集血清并液氮储存;将高原对照组和高原给药组大鼠暴露于低压低氧环境.高原对照组用0 9%生理盐水灌胃,高原给药组用二十味沉香丸制成的水剂灌胃.高原对照组、高原给药组分别于1、3、7、15、30 d,各取15只大鼠,测定大鼠体质量、Hb、Hct,用ELISA法检测血清EPO.结果 高原对照组大鼠高原暴露第3、7、15、30天Hb和Hct水平较平原对照组有所升高,但明显低于高原给药组(P均<0.05).高原对照组血清EPO表达随大鼠暴露时间延长而增强(P均<0.05).高原给药组血清EPO表达在大鼠暴露15 d左右略有升高(P<0 05),但30 d时又恢复至正常水平.高原对照组血清EPO表达水平与Hb呈正相关(r=0.83,P<0.05).结论 二十味沉香丸可降低低压低氧暴露大鼠的Hb和Hct,可能是通过干预EPO的表达起作用.

目的:研究不同低氧暴露时间对小鼠骨骼肌雌激素受体相关受体(estrogen receptor related receptors α,ERRα)与丙酮酸脱氢酶激酶4(PαK4)DNA结合活性及PDK4基因表达的影响,以探讨低氧条件下影响糖代谢及其信号分子之间的相互调节可能的机制.方法:野生小鼠随机分为常氧组、低氧组(氧浓度11.25%左右,模拟海拔高度4500m),而后又进一步分为0天、7天、14天、28天组,每组10只.低氧暴露时间为每天8h.同天数的小鼠常氧组与低氧组脱颈处死.染色质免疫共沉淀法(Chip)测定ERRα/PDK4结合活性,Real-TimePCR测定骨骼肌PDK4mRNA含量.结果:1)随着天数增加,低氧组ERRα/PDK4的结合活性有增加的趋势,但没有显著性差异;2)随着天数增加,低氧28天组PDK4mRNA相对表达量与0天组相比显著性升高(P〈0.05),且与28天常氧组相比也有显著性增加(P〈0.05).结论:低氧28天小鼠骨骼肌PDK4mRNA相对表达量显著增加,但其ERRα/PDK4的结合活性并没有显著性变化,推测低氧下蛾并不是促进PDK4mRNA表达的主要转录因子.

目的:通过siRNA技术沉默宫颈癌细胞转酮醇酶样基因-1(TKTLl)后观察其在缺氧条件下低氧诱导因子1d(HIF-10[)表达水平及糖酵解途径中2个关键酶己糖激酶Ⅱ(HK-Ⅱ)和乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化情况,旨在探讨肿瘤细胞TKTLl表达与糖酵解途径的关系.方法:用构建的靶向TKTLl基因siRNA干扰质粒载体转染HeLa细胞株,RT-PCR检测TKTLlmRNA表达并结合转酮醇酶(TKT)活性测定判断其干扰效率;以未转染HeLa细胞为对照,进一步观察TKTLl沉默的癌细胞在缺氧条件下HIF-1仪和HK.Ⅱ表达水平,以及HK.U和LDH活性的变化.结果:siRNA沉默HeLa细胞TKTLl基因后TKTLlmRNA表达下降,TKT活性显著降低(P〈0.01),HIF-1α和HK-Ⅱ表达水平及HK-Ⅱ和LDH活性较对照组细胞均显著降低(P〈0.01).结论:沉默肿瘤细胞TKTLl基因能下调HIF-1仪表达并降低糖酵解代谢关键酶活性,从而影响肿瘤细胞的恶性表型.