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真核表达载体pIRES2-ZsGreenl-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达

原文链接：万方

• 作者：

  李艳玲,王颖,党文庆,郝柱,徐宁迎,张金枝

• 摘要：

  α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义.本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreenl-opLA,将其转染至猪(Sus scrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人仪一LA的细胞.根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2一ZsGreenl真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2一ZsGreenl-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了plRES2-ZsGreenl-opLA和pIRES2一ZsGreenl空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到.本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreenl-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞.

• 关键词：

  α-乳清蛋白（α-LA） 真核表达载体 转染 猪 成纤维细胞 α-lactalbumin（α-LA） Eukaryotic expression vector Transfection Pig Fibroblast

• 作者单位：

  浙江大学动物科学学院,杭州310058

• 基金项目：

  国家转基凶生物新品种培育重大专项（No.2008ZX08006.003和No.2009ZX08006.009B）

• 来源期刊：

  农业生物技术学报

• 年，卷(期)：

  201220008