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人LMP-1基因腺病毒蚕组体的构建及其在骨肉瘤细胞U20S中的表达

原文链接：万方

• 作者：

  刘会文,黄路,韩智敏,罗嘉全,杨东,詹平,戴闽,曹凯

• 摘要：

  目的:构建表达人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)细胞系U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达.方法:以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对LMP-1进行扩增,通过TA克隆与pGEM-T载体连接并DNA测序.双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和DNA测序鉴定,并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达.线性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒Ad-LMP-1.通过脂质体介导,在HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1,大量扩增、纯化并测定滴度.用Ad-LMP-1感染OS细胞系U2OS,通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测LMP-1在U2OS细胞中的表达.结果:双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功,荧光显微镜证实转染了pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组.通过扩增、纯化,Ad-LMP-1滴度达到1.5*109pfu/ml.荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的U2OS内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot检测发现重组腺病毒感染U2OS后,LMP-1的mRNA和蛋白表达量明显高于对照组.结论:成功构建了人LMP-1基因腺病毒重组体,为进一步的实验研究奠定了基础.

• 关键词：

  LIM矿化蛋白-1 重组腺病毒载体 表达载体构建 骨肉瘤细胞 LIM mineralization protein-1 recombinant adenoviral vector construction of expression vetor osteosarcoma cells

• 作者单位：

  南昌大学第一附属医院骨科,南昌330006%江西省妇幼保健院儿保科,南昌330006

• 基金项目：

  江西省教育厅科研基金资助项目（编号：GJJ07095,GJJ08076）;江西省自然科学基金资助项目（编号：2009GQY0204）.

• 来源期刊：

  重庆医科大学学报

• 年，卷(期)：

  201237007