科创中国

目的 探讨核因子E2相关因子2(Nrf2)在氢气改善脓毒症小鼠脑功能障碍中的作用.方法 按随机数字表法将雄性ICR小鼠分为假手术组、氢气对照组、脓毒症组和氢气治疗组,每组20只.采用盲肠结扎穿孔术(CLP)制备脓毒症模型;氢气治疗组于术后1h、6h吸入2%氢气1h.各组于术后24 h取脑组织,光镜下观察海马组织病理学改变和神经元凋亡情况;蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测海马组织核Nrf2和总Nrf2的蛋白表达;检测海马组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、8-异前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)的水平.术后4~9d通过Morris水迷宫实验检测小鼠的学习和记忆能力.结果 与假手术组和氢气对照组比较,脓毒症组海马CA1区正常椎体神经元明显减少,神经元凋亡指数明显增高;核Nrf2和总Nrf2表达明显增加;海马SOD和CAT活性明显降低,MDA和8-iso-PGF2α浓度明显增高;术后4~8d小鼠逃避潜伏期明显延长,游泳速度无差异,探索期在目标象限时间百分比和穿过站台次数明显减少.与脓毒症组相比,氢气治疗组海马CA1区正常椎体神经元明显增加(个:67.33±6.89比42.33±6.02,P<0.01),神经元凋亡指数明显降低[(30.00±4.77)%比(80.50±6.99)%,P<0.01];核Nrf2和总Nrf2表达均明显增加[核Nrf2(A值):5.07±0.35比3.04±0.34,总Nrf2(A值):4.24±0.58比2.91±0.37,均P<0.01];海马SOD和CAT活性明显提高[SOD (U/mg):120.96±13.44比81.16±12.28,CAT(U/mg):9.11±1.28比5.64±1.88,均P<0.01],MDA和8-iso-PGF2α浓度明显降低[MDA (nmol/mg):16.12±1.49比27.64±1.87,8-iso-PGF2α(pg/mg):183.43±13.07比864.07±49.92,均P<0.01];术后5~8d小鼠逃避潜伏期明显缩短,游泳速度无差异,探索期在目标象限时间百分比[(37.06±1.16)%比(24.42±1.82)%,P<0.01]和穿过站台次数(次:7.13±0.98比4.88±0.99,P<0.01)明显增加.假手术组和氢气对照组各指标差异均无统计学意义.结论 氢气可明显减轻脓毒症小鼠脑组织病理损伤,改善其学习和记忆能力,其机制可能与上调Nrf2、提高机体抗氧化水平及降低氧化产物水平有关.

目的:研究肌原纤维形成调节因子1 (MR-1)是否通过抑制蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/核因子E2相关因子2(Nrf2)途径减轻缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞凋亡.方法:在原代培养的乳大鼠心肌细胞H/R模型上,采用Annexin V/PI双标法检测心肌细胞的凋亡率;以Western blotting检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、磷酸化PERK、Nrf2、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Bcl-2和Bax的蛋白水平,研究过表达或敲低对于H/R致心肌细胞凋亡的影响及其与PERK/Nrf2途径活化的关系.结果:H/R引起心肌细胞凋亡;过表达MR-1减轻H/R引起的细胞凋亡(P<0.01),下调CHOP表达(P<0.05),引起Bcl-2/Bax值升高(P<0.01),并抑制H/R诱导的PERK磷酸化、Nrf2核转位和ATF4表达(P<0.01).敲低MR-1加重H/R引起的细胞凋亡(P<0.01)、CHOP表达上调(P<0.05)和Bcl-2/Bax值下降(P<0.01),并加重H/R诱导的PERK磷酸化(P<0.05)、Nrf2核转位和ATF4表达(P<0.01).结论:MR-1通过抑制PERK/Nrf2途径而减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡.

目的 观察Ⅱ相酶诱导剂5,6-二氢环戊烯并1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(CPDT)对2型糖尿病大鼠视网膜核因子NF-E2相关因子/抗氧化反应元件(Nrf2/ARE)信号通路及氧化应激的影响,探讨CPDT保护糖尿病大鼠视网膜的机制.方法 35只Wistar雄性大鼠随机分为正常组、造模组2个组,造模组中造模成功者再随机分为糖尿病组、CPDT干预组2个组.正常组、造模组分别有8、27只大鼠.糖尿病组和CPDT干预组给予高脂高糖饲料饲养2个月,大鼠空腹12 h后按体重35 mg/kg腹腔注射链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠模型.CPDT干预组成模后1周开始在高脂高糖饲料中添加CPDT.8周后检测3组大鼠血糖、血清丙二醛(MDA)含量,检测正常组和糖尿病组大鼠血脂含量.逆转录聚合酶链反应检测3组大鼠视网膜Nrf2、血红素氧合酶-1(HO-1)mRNA表达,蛋白免疫印迹法检测Nrf2、HO-1蛋白表达,免疫组织化学法检测Nrf2、HO-1在视网膜的表达.结果 25只大鼠成功建立2型糖尿病大鼠模型,成功率为92.6%.糖尿病组大鼠血脂水平较正常组显著升高(F总胆固醇=65.866,F甘油三酯=25.441,F低密度脂蛋白=38.889,P=0.000).各组间大鼠血糖值比较,差异有统计学意义(x2=25.812,P=0.000),且糖尿病组大鼠血糖显著高于正常组和CPDT干预组.各组间大鼠血清MDA含量比较,差异有统计学意义(F=59.545,P=0.000),糖尿病组大鼠血清MDA高于正常组(t=10.523,P=0.000)和CPDT干预组(t=7.766,P=0.000).各组大鼠视网膜Nrf2、HO-1 mRNA比较,差异有统计学意义(FNrf2=19.503,PNrf2=0.000;FHO-1 =9.737,PHO-1 =0.001).与糖尿病组相比,CPDT干预组大鼠视网膜Nrf2、HO-1 mRNA表达明显增高(tNrf2 =3.399,PNrf2=0.002;tHo-1=2.167,PHO-1=0.039).各组大鼠视网膜Nrf2、HO-1蛋白比较,差异有统计学意义(FNrf2=112.823,FHO-1 =119.361,P=0.000).与糖尿病组相比,CPDT干预组大鼠视网膜Nrf2、HO-1蛋白表达明显增高(tNrf2=6.203,tHO-1=6.388,P=0.000).免疫组织化学检测结果显示,Nrf2、HO-1蛋白主要表达于视网膜神经节细胞层、内丛状层、内核层,各组大鼠视网膜Nrf2、HO-1蛋白表达量比较,差异有统计学意义(FNrf2=16.206,FHO-1=46.790,P=0.000).CPDT干预组大鼠视网膜Nrf2、HO-1蛋白的表达量高于糖尿病组(tNrf2 =3.172,PNrf2 =0.003;tHO-1 =6.321,PHO-1=0.000),糖尿病组高于正常组(tNrf2=2.679,PNrf2=0.011; tHO-1=3.482,PHO1=0.001).结论 CPDT可能通过激活Nrf2/ARE信号通路,诱导Nrf2和HO-1的表达,降低血糖、血清MDA含量,从而减轻2型糖尿病大鼠视网膜的氧化应激损伤.

目的:探讨蛋白激酶C(PKC)-红系衍生的核因子相关因子2(Nrf2)对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的大鼠气道上皮细胞血红素加氧酶1(HO-1)表达的影响。方法:通过CSE刺激雄性SD大鼠气道上皮细胞,使用PKC抑制剂RO318220和Nrf2 siRNA,将细胞分为对照组、CSE 3 h组、RO318220组、Nrf2 siRNA组和RO318220+Nrf2 siRNA组,用Western blotting法分别检测HO-1、Nrf2和p-PKC蛋白表达,免疫细胞化学法观察HO-1蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)法检测HO-1 mRNA表达,免疫荧光法检测Nrf2蛋白定位,测定HO-1活性。结果:暴露CSE 3 h后,Nrf2蛋白主要表达在胞核,胞核蛋白表达增强,p-PKC蛋白、HO-1的mRNA和蛋白高表达, HO-1活性增强。预先给予RO318220,PKC蛋白、Nrf2胞浆和胞核蛋白、HO-1的mRNA和蛋白表达均明显减弱, HO-1活性显著降低。预先用siRNA沉默Nrf2,胞浆和胞核的Nrf2蛋白表达均减弱,HO-1活性、mRNA和蛋白水平明显降低。 RO318220联合Nrf2 siRNA处理后,PKC蛋白、Nrf2胞浆和胞核蛋白、HO-1 mRNA和蛋白表达均明显降低,HO-1活性明显降低。结论:CSE通过PKC激活Nrf2,诱导Nrf2核转位,从而上调HO-1的表达水平。

目的:观察Toll样受体2/核转录因子-κB(TLR2/NF-κB)信号通路预处理在呼吸机相关性肺损伤(VILI)中的作用。方法将30只雄性SD大鼠按随机数字表法分为3组,每组10只。A组:经气管导管缓慢滴入10μg/kg TLR2单克隆抗体(TLR2-mAb)200μL干预后,40 mL/kg潮气量(VT)行机械通气;B组:8 mL/kg VT行机械通气;C组:滴入10μg/kg无生物学活性的TLR2-mAb作为同型抗体干预后,40 mL/kg VT行机械通气。于通气4h计算肺湿/干质量(W/D)比值,镜下观察肺组织病理学及细胞超微结构改变;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织TLR2、NF-κB及髓样分化因子88(MyD88)的mRNA表达。结果显微镜下观察显示:A、B组肺组织无明显病理学改变,肺泡巨噬细胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞超微结构无明显损伤;C组可见明显肺泡腔融合,肺间隔增宽,大量炎性细胞聚集,肺泡巨噬细胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞胞膜破坏,胞质大量空泡化,细胞器破坏严重,细胞核固缩,核周隙明显增宽。A、B组肺W/D比值以及血清和BALF中炎症细胞因子水平均较C组明显降低〔肺W/D比值:1.151±0.026、1.128±0.048比1.403±0.062;血清IL-1β(ng/L):37.05±5.61、34.52±4.31比51.45±8.18,IL-6(ng/L):53.65±5.16、55.77±5.62比89.96±7.08,TNF-α(ng/L):71.93±13.29、67.36±11.42比96.20±11.60;BALF中 IL-1β(ng/L):56.48±6.16、54.44±7.26比99.77±8.41,IL-6(ng/L):172.44±21.26、163.47±18.70比216.22±23.90,TNF-α(ng/L):235.81±42.75、231.72±40.38比374.85±69.61,均P<0.01〕,而A组与B组上述指标差异均无统计学意义(均P>0.05)。A、B组肺组织TLR2、MyD88和NF-κB的mRNA表达均明显低于C组〔TLR2 mRNA(2-ΔΔCt):1.021±0.287、0.938±0.196比3.862±0.871,MyD88 mRNA(2-ΔΔCt):1.235±0.277、1.300±0.306比3.618±1.107,NF-κB mRNA(2-ΔΔCt):0.519±0.036、1.043±0.170比20.280±9.466,P<0.05或P<0.01〕,而A组与B组上述因子基因表达差异均无计学意义(均P>0.05)。结论 TLR2-mAb预处理通过阻断TLR2/NF-κB信号通路可减轻VILI模型大鼠炎症细胞因子的释放,在一定程度上减轻VILI。

目的:研究亚低温对脂多糖(LPS)吸入导致的急性肺损伤(ALI)大鼠Toll样受体2/髓样分化因子88(TLR2/MyD88)通路中TLR2、MyD88、核转录因子-κBp65(NF-κBp65)及相关炎性蛋白纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达的影响.方法将90只雄性SD大鼠按随机数字表法分成对照组(n=18)、亚低温组(n=24)、控温组(n=24)、非控温组(n=24).用气管内滴入LPS 0.5 mL/kg方法建立ALI模型,对照组滴入等量生理盐水;1 h后取颈动脉血并予以物理降温,亚低温组、控温组分别控制肛温在32~34℃、36~37℃,对照组、非控温组体温不加干预.分别于制模前、制模后1 h及干预后1、6、12 h进行血气分析;分别于干预后1、6、12 h处死大鼠,光镜下观察肺组织病理改变并进行半定量评分;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中PAI-1蛋白表达;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织TLR2 mRNA、MyD88 mRNA表达;蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测肺组织NF-κBp65蛋白表达.结果滴入LPS后,各组氧合指数(PaO2/FiO2)明显降低,肺组织损伤加重,肺损伤评分、BALF中PAI-1、肺组织TLR2 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κBp65蛋白表达均明显升高.给予亚低温治疗后各指标均明显改善,亚低温疗程持续6 h时效果最好,持续6~12 h可能获益.与控温组比较,亚低温组PaO2/FiO2(mmHg,1 mmHg=0.133 kPa)于干预后1 h、6 h明显升高(1 h:402.49±38.61比324.36±28.93,6 h:349.72±98.20比284.35±13.68,均P<0.01);肺损伤评分(分)于干预后1、6、12 h明显降低(1 h:6.04±0.74比7.96±0.65,6 h:9.09±0.80比13.13±1.02,12 h:10.79±1.42比13.42±0.68,均P<0.01);BALF中PAI-1蛋白表达(ng/L)于干预后1、6、12 h明显下降(1 h:121.36±4.62比197.74±9.42,6 h:230.53±10.76比294.06±16.60,12 h:270.48±13.20比319.40±10.24,均P<0.01?

目的 以缺氧/再复氧(H/R)和脂多糖(LPS)刺激人结肠上皮细胞株(FHC)模拟体内肠上皮细胞遭受缺血、缺血/再灌注和炎症打击的病理过程,探讨大黄素干预的可能作用靶点.方法 常氧组:在37 ℃下用95%空气和5%CO2培养.缺氧(H)组:于37℃下用1%O2、5%CO2和94%N2的混合厌氧气体使细胞缺氧1、2、3、4h.H+LPS组:在H组基础上给予LPS 1 mg/L刺激.H/R组:于缺氧3h后分别复氧1、2、3、4h.H/R+LPS组:在H/R基础上给予LPS 1 mg/L刺激.大黄素干预组:在H3 h/R2 h+LPS基础上给予20、40、60、80 μmol/L大黄素进行干预.用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测磷酸化核转录因子-κB(NF-κB)抑制蛋白-α(pIκB-α)、磷酸化NF-κBp65(pNF-κBp65)、环氧化酶-2(COX-2)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白表达.相差显微镜下观察各组肠上皮细胞的形态学改变;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测大黄素对肠上皮细胞增殖情况的影响.结果 ①H组:pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2表达量均于H1 h达峰值,分别为0.350±0.018、1.083±0.054、0.903±0.045,然后递减(F值分别为3.011、7.247、5.754,P值分别为0.013、0.000、0.005);HIF-1α在H3 h表达最高(1.511±0.076),但各时间点间比较无差异(F=1.881,P=0.062).H+LPS组:pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α表达量均随缺氧时间延长而增加,H3 h达峰值,分别为0.504±0.025、1.255±0.063、0.812±0.041、1.209±0.075(F值分别为2.683、8.774、9.765、2.432,P值分别为0.011、0.000、0.000、0.026).H/R组:随着再复氧时间延长,pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2表达递减,于H3 h/R4 h降至最低,分别为0.712±0.034、1.202±0.048、0.691±0.042(F值分别为1.923、6.765、2.719,P值分别为0.063、0.000、0.016);与H组相比,H/R组HIF-1α在再复氧过程中表达明显减少,但各时间点间无差异(F=1.280,P=0.081).H/R+LPS组:随着再复氧时间延长,pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α并无降解,于R2~3 h达峰值,分别为3.302±0.061、2.315±0.055、2.017±0.043、2.413±0.098(F值分别为4.614、1.652、5.970、2.076,P值分别为0.001、0.067、0.000、0.037).大黄素共同干预组:大黄素可以抑制NF-κB和HIF-1α通路蛋白表达,存在量效关系(P<0.05或P<0.01).80 μmol/L大黄素可使pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α蛋白表达量降至最低,分别为2.599±0.130、1.772±0.089、2.590±0.129、2.518±0.125;大黄素后处理细胞则无此效果.②经过H/R+LPS处理的细胞内发生空泡样变、形态改变、细胞融合,相比H组生长速度缓慢.③MTT法检测结果显示,20~ 80 μmol/L大黄素对细胞增殖无明显影响,说明大黄素在此浓度范围不仅产生了生物学效应,且对细胞无药物毒性.结论 缺氧或炎症均可激活HIF-1α的缺氧通路和NF-κB的炎症通路,在H/R过程中,这两条通路蛋白随着再复氧时间延长表达降低,但在H/R+LPS过程中蛋白仍相对高表达,缺血/再灌注损伤可能与内毒素共同作用破坏肠上皮细胞,导致肠源性脓毒症的发生.在炎症早期阶段而非晚期阶段,用大黄素可以阻断NF-κB/HIF-1 α-COX-2信号通路,从而发挥抗炎作用.

目的 探讨缺氧诱导因子-2α(hypoxia-inducible factors-2α,HIF-2α)siRNA对乳腺癌细胞MCF-7增殖能力的影响及相关机制.方法 采用CoCl2处理细胞,建立细胞缺氧模型,应用RNA干扰技术沉默MCF-7细胞中HIF-2α的表达;运用RT-PCR技术检测转染后MCF-7细胞中HIF-2α mRNA的表达;绘制细胞生长曲线,观察细胞生长速度和倍增时间;通过流式细胞术观察细胞周期分布的改变;采用RT-PCR技术检测增殖相关基因的表达.结果 细胞缺氧模型建立成功.RNA干扰结果显示:缺氧+siRNA组HIF-2α mRNA的表达与单纯缺氧组相比明显降低(P<0.05);细胞生长曲线结果显示:缺氧+siRNA组与单纯缺氧组相比,细胞生长速度明显减慢,倍增时间显著延长(P均<0.05);细胞周期结果显示:缺氧+siRNA组与单纯缺氧组相比,S期和G2/M期细胞比例显著减少(P<0.05);RT-PCR结果显示:缺氧+siRNA组与单纯缺氧组相比,p21基因表达上调(P<0.05),Cyclin B基因表达下调(P<0.05).结论 HIF-2α siRNA可抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖能力,可能与p21基因表达上调、Cyclin B基因表达下调有关.

目的:研究大麻素CB2受体激动剂JWH133对百草枯中毒致急性肺损伤大鼠的保护作用。方法:72只SD雄性大鼠随机平均分成4组。百草枯中毒组:按照20 mg/kg剂量腹腔注射;低剂量JWH133预处理组:在给予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射5 mg/kg JWH133;高剂量JWH133预处理组:在给予百草枯腹腔注射前1 h腹腔注射20 mg/kg JWH133;正常对照组:1 mL生理盐水腹腔注射。在注射百草枯后8 h、1 d和3 d时,收集动脉血、肺泡灌洗液和肺组织标本。采用血气分析仪测定动脉血氧分压( PaO2),采用ELISA方法检测支气管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量,行组织切片HE染色进行肺损伤评分,利用Western blotting方法检测肺组织中NF-κB和AP-1蛋白表达水平。结果:与正常对照组相比,百草枯中毒组大鼠的动脉血PaO2明显下降,肺组织结构破坏,肺泡间质水肿,肺损伤指数增加,支气管肺泡灌洗液中炎性细胞因子IL-1β和TNF-α含量明显增加。 JWH133预处理,尤其是高剂量JWH133可以减轻肺组织损伤程度,降低支气管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α含量,减少肺组织中NF-κB和AP-1蛋白的表达。结论:应用CB2受体激动剂JWH133可以抑制百草枯中毒大鼠肺组织中NF-κB和AP-1蛋白的表达,减少炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的分泌,减轻百草枯中毒导致的急性肺损伤。

目的:探索CDX2过表达对人胃癌SGC-7901细胞增殖、生长和细胞周期的影响及其分子机制。方法:采用携带CDX2基因的重组慢病毒颗粒( LV-CDX2-GFP)感染SGC-7901细胞,作为实验组( LV-CDX2-GFP组);以对照慢病毒颗粒( LV-GFP)感染SGC-7901细胞,作为阴性对照组( LV-GFP组);空白对照组常规培养,不做任何处理。分别采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,流式细胞术检测各组细胞周期的分布,半定量逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR)和Western blotting 技术检测细胞中CDX2、Bax、Bcl-2、cyclin D1和survivin mRNA和蛋白的表达。结果:与LV-GFP组和空白对照组比较,LV-CDX2-GFP组细胞增殖活力明显降低(P<0.05),G0/G1期所占比例上升(P<0.05),Bcl-2、cyclin D1和survivin mRNA和蛋白的表达降低(P<0.05),Bax mRNA和蛋白的表达上调(P<0.05),而LV-GFP组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:慢病毒介导的CDX2过表达抑制胃癌细胞增殖和生长,使细胞周期停滞在G0/G1期,其机制可能与CDX2过表达使胃癌细胞Bcl-2、cyclin D1、survivin表达下调和Bax表达上调有关。