科创中国

目的:研究肿瘤相关转录因子YY1 对口腔鳞癌细胞整合素β6(integrin β6,ITGB6)基因表达调控的影响.方法:用生物信息学方法预测分布在ITGB6启动子区域的转录因子YY1潜在的结合位点,构建萤光素酶报告基因质粒,利用双萤光素酶报告基因系统检测ITGB6启动子片段的转录活性;利用染色质免疫沉淀技术检测在天然染色质条件下转录因子YY1与ITGB6启动子的结合情况;采用定点突变方法检测YY1结合位点对ITGB6启动子活性的影响;利用RT-PCR方法检测过表达转录因子YY1对口腔鳞癌细胞ITGB6 mRNA表达水平的影响.结果:ITGB6启动子-421~-150 nt区域存在多个转录因子YY1潜在的结合位点.在口腔鳞癌细胞的天然染色质中,转录因子YY1结合于ITGB6启动子-421~-150 nt区域;定点突变YY1潜在结合位点对口腔鳞癌细胞中ITGB6启动子活性无显著影响.另外,过表达的YY1对口腔鳞癌细胞ITGB6 mRNA的表达水平也无影响.结论:转录因子YY1在口腔鳞癌细胞中结合于ITGB6基因启动子-421~-150 nt区域,但对ITGB6基因的基础转录水平无影响.

目的:研究川崎病患儿细胞免疫功能状况及转录因子T-bet和GATA3的调控作用。方法:选取41例川崎病患儿为研究对象,同时选取年龄和性别相匹配的因急性上呼吸道感染发热儿童40例为对照组,分别采用三色荧光流式细胞术和半定量逆转录-聚合酶链反应检测2组患儿外周血Th1、Th2细胞数量及单个核细胞中T-bet和GATA3 mRNA水平。结果:川崎病患儿外周血Th1、Th2细胞比率及单个核细胞转录因子T-bet mRNA、GA-TA3 mRNA转录水平分别为(10.36±3.69)%、(6.46±2.28)%、0.51±0.16和0.38±0.13,均显著低于对照组[(25.26±5.22)%、(16.87±4.35)%、0.62±0.21和0.46±0.12,P<0.05]。 Spearman相关分析显示Th1和Th2细胞比率分别与T-bet mRNA和GATA3 mRNA水平呈正相关。结论:川崎病患儿急性期T细胞并非活化而是处于抑制状态,T-bet和GATA3分别对Th1和Th2细胞增殖具有调控作用。

目的:探索异丹叶大黄素(ISO)下调肿瘤细胞中细胞周期蛋白D1表达的分子机制.方法:以ISO作用于人源性膀胱癌UMUC3、RT12和RT4细胞后用Western blotting法检测细胞周期蛋白D1表达水平;以RTPCR法检测细胞周期蛋白D1 mRNA的表达水平.稳定转染细胞周期蛋白D1启动子萤光素酶报告基因至UMUC3细胞并筛选后,检测ISO预处理后萤光素酶活性.ISO预处理UMUC3细胞后,提取核蛋白检测核转录因子表达水平的变化.分别稳定转染GFP和GFP-细胞周期蛋白D1表达构建载体,筛选克隆;ISO预处理后,Western blotting 法检测细胞周期蛋白D1的蛋白表达水平,贴壁依赖性细胞生长实验法检测细胞生长能力的变化,流式细胞术检测细胞周期的变化.分别稳定转染人源性细胞周期蛋白D1野生型和-163位点突变型萤光素酶报告基因质粒载体至UMUC3细胞并筛选,ISO预处理后检测细胞的萤光素酶活性.最后利用染色质免疫沉淀的方法,以抗Sp1抗体检测ISO对Sp1与细胞周期蛋白D1启动子结合力的影响.结果:ISO可从mRNA和蛋白水平显著抑制肿瘤细胞的细胞周期蛋白D1水平,并且是从内源性转录水平来抑制细胞周期蛋白D1的转录.ISO可抑制、下调核转录因子Sp1的表达,并抑制Sp1与细胞周期蛋白D1启动子区域的结合力,该结合位点主要位于启动子-92到+27bp的5’-非翻译区.结论:ISO可通过下调Sp1核转录因子表达及其与细胞周期蛋白D1启动子的结合,从内源性转录水平来抑制细胞周期蛋白D1的表达,从而诱导G0/G1细胞周期阻滞并抑制肿瘤细胞增殖.我们的研究将为临床中药单体ISO综合治疗肿瘤提供新的策略.

目的:为进一步探讨miRNA-24是否参与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的调控及其对血管内皮细胞增殖的影响,本研究构建miRNA-24高表达质粒,并用脂质体将其导入人脐静脉内皮细胞( HUVECs ),观察miRNA-24对eNOS表达及HUVECs增殖的影响。方法:用四甲基偶氮唑蓝( MTT)法检测细胞增殖情况,RT-PCR、免疫组织化学和Western blotting检测eNOS与Sp1转录因子mRNA和蛋白表达水平。结果:与对照组比较, miR-NA-24高表达组细胞增殖减慢41.97%(0.47±0.04 vs 0.81±0.03, P<0.01),eNOS mRNA降低44.8%(0.48±0.01 vs 0.87±0.03,P<0.05),蛋白表达减少71.92%(0.16±0.06 vs 0.57±0.08,P<0.05);同时Sp1 mRNA降低53.00%(0.45±0.02 vs 0.93±0.01,P<0.05),其蛋白质表达量也相应减少62.31%(0.13±0.07 vs 0.31±0.09, P<0.05)。 miRNA-24抑制组中,上述指标比对照组降低,但比miRNA-24高表达组明显升高。结论:miRNA-24高表达明显抑制HUVECs的增殖及eNOS的表达;Sp1可能是参与miRNA-24调控eNOS表达的重要因素之一。

目的:观察转录因子Sp3对β-catenin启动子转录活性的影响,探讨Sp3与Wnt/β-catenin信号通路的关系.方法:采用脂质体法将Sp1和(或)Sp3转录因子表达质粒单独/共同与β-catenin启动子(-410/-1bp)报告基因质粒瞬时转染HEK293T细胞;通过双萤光素酶报告基因实验检测报告基因转录活性的变化.结果:(1)Sp1表达质粒在0.4μg剂量时能提高启动子的活性2.4倍,Sp3表达质粒在0.4μg剂量时能显著提高启动子的活性5.3倍.(2)0.4μg总量的Sp1与Sp3表达质粒共转染293T细胞,随着Sp3/Sp1比例的递增,β-catenin启动子转录活性无明显变化.(3)共同转染Sp1 0.3μg与Sp3 0.1μg时,启动子活性提高3.5倍,比单独转染的转录活性强.结论:Sp3能促进β-catenin基因启动子(-410/-1 bp)的转录,Sp1的转录激活作用则较弱;在转录过程中Sp1和Sp3可能存在协同作用;Sp3可能在转录水平调控β-catenin的表达从而影响Wnt/β-catenin信号通路.

目的:通过siRNA技术沉默宫颈癌细胞转酮醇酶样基因-1(TKTLl)后观察其在缺氧条件下低氧诱导因子1d(HIF-10[)表达水平及糖酵解途径中2个关键酶己糖激酶Ⅱ(HK-Ⅱ)和乳酸脱氢酶(LDH)活性的变化情况,旨在探讨肿瘤细胞TKTLl表达与糖酵解途径的关系.方法:用构建的靶向TKTLl基因siRNA干扰质粒载体转染HeLa细胞株,RT-PCR检测TKTLlmRNA表达并结合转酮醇酶(TKT)活性测定判断其干扰效率;以未转染HeLa细胞为对照,进一步观察TKTLl沉默的癌细胞在缺氧条件下HIF-1仪和HK.Ⅱ表达水平,以及HK.U和LDH活性的变化.结果:siRNA沉默HeLa细胞TKTLl基因后TKTLlmRNA表达下降,TKT活性显著降低(P〈0.01),HIF-1α和HK-Ⅱ表达水平及HK-Ⅱ和LDH活性较对照组细胞均显著降低(P〈0.01).结论:沉默肿瘤细胞TKTLl基因能下调HIF-1仪表达并降低糖酵解代谢关键酶活性,从而影响肿瘤细胞的恶性表型.

机体的生长发育离不开细胞内基因表达的调控.基因表达调控的关键是转录因子结合到特定的DNA序列,并随后调控基因的转录.有大量的转录因子使用一个保守的锌指结构域结合自己的目标DNA片段.三重基序蛋白(tripartite motif,TRIM)家族都具有相同的结构域,即N-末端的RING-Bbox-coiled-coil(RBCC)基因序列、bromo结构域、保守中心序列区以及C-末端的PHD指状结构域,此外该家族还都具有一个可变的C-末端,因此TRIM家族也称为RBCC家族.自从1991年

目的:构建含NADPH氧化酶1(NOX1)近端启动子区的pGL3萤光素酶报告基因载体及缺失NF-κB结合元件的相应载体,分别测定其相应活性,探讨NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子区转录活性的影响.方法:采用PCR法克隆NOX1启动子区序列(1 415 bp),将目的片段与pGL3萤光素酶载体分别双酶切、纯化后进行连接(pGL3-NOX1-1415),测序鉴定;应用Alibaba 2.1软件分析NOX1近端启动子区,获取NF-κB结合元件;重叠PCR法将含该元件的启动子区域(88 bp)缺失,并构建相应载体(pGL3-NOX1-1327).将两载体分别与pRL-TK内参质粒瞬时转染进入A549细胞,采用TNF-α(10μg/L)刺激细胞24 h,萤光酶标仪检测A549细胞的萤光素酶活性.结果:测序鉴定结果提示pGL3-NOX1-1415及NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327载体构建成功;细胞实验显示,TNF-α刺激后,转染pGL3-NOX1-1415的A549细胞萤光素酶活性明显强于对照组(P<0.05),而转染NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327的细胞萤光素酶活性明显低于转染pGL3-NOX1-1415组(P<0.05).结论:TNF-α诱导A549细胞NOX1基因活化与NF-κB密切相关,NF-κB参与了TNF-α诱导的NOX1基因启动子的转录调控.

目的 以缺氧/再复氧(H/R)和脂多糖(LPS)刺激人结肠上皮细胞株(FHC)模拟体内肠上皮细胞遭受缺血、缺血/再灌注和炎症打击的病理过程,探讨大黄素干预的可能作用靶点.方法 常氧组:在37 ℃下用95%空气和5%CO2培养.缺氧(H)组:于37℃下用1%O2、5%CO2和94%N2的混合厌氧气体使细胞缺氧1、2、3、4h.H+LPS组:在H组基础上给予LPS 1 mg/L刺激.H/R组:于缺氧3h后分别复氧1、2、3、4h.H/R+LPS组:在H/R基础上给予LPS 1 mg/L刺激.大黄素干预组:在H3 h/R2 h+LPS基础上给予20、40、60、80 μmol/L大黄素进行干预.用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测磷酸化核转录因子-κB(NF-κB)抑制蛋白-α(pIκB-α)、磷酸化NF-κBp65(pNF-κBp65)、环氧化酶-2(COX-2)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白表达.相差显微镜下观察各组肠上皮细胞的形态学改变;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测大黄素对肠上皮细胞增殖情况的影响.结果 ①H组:pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2表达量均于H1 h达峰值,分别为0.350±0.018、1.083±0.054、0.903±0.045,然后递减(F值分别为3.011、7.247、5.754,P值分别为0.013、0.000、0.005);HIF-1α在H3 h表达最高(1.511±0.076),但各时间点间比较无差异(F=1.881,P=0.062).H+LPS组:pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α表达量均随缺氧时间延长而增加,H3 h达峰值,分别为0.504±0.025、1.255±0.063、0.812±0.041、1.209±0.075(F值分别为2.683、8.774、9.765、2.432,P值分别为0.011、0.000、0.000、0.026).H/R组:随着再复氧时间延长,pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2表达递减,于H3 h/R4 h降至最低,分别为0.712±0.034、1.202±0.048、0.691±0.042(F值分别为1.923、6.765、2.719,P值分别为0.063、0.000、0.016);与H组相比,H/R组HIF-1α在再复氧过程中表达明显减少,但各时间点间无差异(F=1.280,P=0.081).H/R+LPS组:随着再复氧时间延长,pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α并无降解,于R2~3 h达峰值,分别为3.302±0.061、2.315±0.055、2.017±0.043、2.413±0.098(F值分别为4.614、1.652、5.970、2.076,P值分别为0.001、0.067、0.000、0.037).大黄素共同干预组:大黄素可以抑制NF-κB和HIF-1α通路蛋白表达,存在量效关系(P<0.05或P<0.01).80 μmol/L大黄素可使pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α蛋白表达量降至最低,分别为2.599±0.130、1.772±0.089、2.590±0.129、2.518±0.125;大黄素后处理细胞则无此效果.②经过H/R+LPS处理的细胞内发生空泡样变、形态改变、细胞融合,相比H组生长速度缓慢.③MTT法检测结果显示,20~ 80 μmol/L大黄素对细胞增殖无明显影响,说明大黄素在此浓度范围不仅产生了生物学效应,且对细胞无药物毒性.结论 缺氧或炎症均可激活HIF-1α的缺氧通路和NF-κB的炎症通路,在H/R过程中,这两条通路蛋白随着再复氧时间延长表达降低,但在H/R+LPS过程中蛋白仍相对高表达,缺血/再灌注损伤可能与内毒素共同作用破坏肠上皮细胞,导致肠源性脓毒症的发生.在炎症早期阶段而非晚期阶段,用大黄素可以阻断NF-κB/HIF-1 α-COX-2信号通路,从而发挥抗炎作用.

目的:研究转录因子Bach1对人微血管内皮细胞功能的影响。方法:利用小干扰RNA( small inter-fering RNA,siRNA)细胞转染技术下调内皮细胞Bach1表达;用Matrigel管腔形成实验检测内皮细胞体外血管新生的能力;用Transwell小室法检测细胞迁移;用CCK-8法测定细胞增殖;用实时荧光定量PCR、Western blotting和ELISA法检测细胞中血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) mRNA和蛋白的表达情况;用转染报告基因的方法检测VEGF基因的转录活性。结果:下调内皮细胞Bach1表达明显促进人微血管内皮细胞迁移和管腔形成能力,对内皮细胞增殖能力无明显影响;抑制Bach1表达促进内皮细胞HO-1 mRNA和蛋白的表达,增加VEGF转录活性及mRNA和蛋白的表达。结论:抑制转录因子Bach1表达可增加内皮细胞HO-1和VEGF的表达,促进人微血管内皮细胞迁移和管腔形成,提示Bach1是负性调控血管新生的因子。