科创中国

目的探讨血管内皮生长因子-C(VEGF-C)与真核细胞核转录因子B(NF-κB)在乳腺癌发生、发展中的作用.方法采用免疫组织化学SP法检测VEGF-C与NF-κB在59例乳腺癌、17例乳腺导管内癌及20例正常乳腺组织中的表达,并分析其与乳腺癌临床病理因素和患者生存期的关系.结果 VEGF-C和NF-κB在乳腺癌、乳腺导管内癌、正常乳腺组织中阳性表达率有明显差异(71.2%、47.1%、0和62.7%、41.2%、10.0%)(P

目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)对创伤弧菌脓毒症肺损伤的保护作用及机制.方法采用全骨髓贴壁培养法分离小鼠BMSC.按照随机数字表法将雄性ICR小鼠分为生理盐水对照组(NS组)、生理盐水+BMSC对照组(NSB组)、创伤弧菌脓毒症组(VV组)、创伤弧菌脓毒症+BMSC治疗组(VVB组),每组40只.于小鼠左侧腹腔注射1×107 cfu/mL创伤弧菌悬液5 mL/kg制备脓毒症模型;于制模后经尾静脉注射4×105 cfu/mL BMSC 5 mL/kg进行干预.各组分别于染菌后6、12、24、48 h取10只小鼠的肺组织,计算肺湿/干质量(W/D)比值;蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞核内核转录因子-κBp65(NF-κBp65)表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肺组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-1β、IL-6)水平;苏木素-伊红(HE)染色及醋酸铀-枸橼酸铅双染后于镜下观察肺组织病理学改变.结果 VV组染毒后各时间点肺W/D比值、肺组织细胞核内NF-κBp65表达量及肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6表达均较NS组明显升高,且于12 h达峰值;VVB组肺W/D比值、NF-κBp65表达量及TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显低于VV组同时间点〔12 h VV组比NS组:肺W/D比值7.22±0.03比5.21±0.02,NF-κBp65表达量(灰度值)1.86±0.74比0.75±0.07,TNF-α(ng/L)433.24±3.23比106.57±1.21,IL-1β(ng/L)35.64±0.15比10.64±0.48,IL-6(ng/L)58.84±0.55比17.69±1.35,均P<0.05;12 h VVB组比VV组:肺W/D比值6.49±0.06比7.22±0.03, NF-κBp65表达量(A值)1.16±0.08比1.86±0.74,TNF-α(ng/L)357.22±3.25比433.24±3.23,IL-1β(ng/L)27.77±0.59比35.64±0.15,IL-6(ng/L)38.68±1.29比58.84±0.55,均P<0.05〕.NS组和NSB组各指标比较差异均无统计学意义.光镜下显示NS组和NSB组肺组织病理改变不明显;VV组肺组织充血、水肿,肺泡腔内可见水肿液、红细胞,炎性细胞浸润;VVB

目的 探讨生长抑素(SST)对内毒素致急性肺损伤(ALI)小鼠炎症反应的影响及其机制.方法 将72只SPF级雄性ICR小鼠按随机数字表法分为对照组、SST对照组、模型组和SST干预组,每组18只.采用腹腔注射内毒素40 mL/kg制备ALI模型,对照组则给予等量生理盐水;SST干预组于制模后0.5、2、6、12h皮下注射SST(20 μg,20 mL/kg).各组于首次给药后3、8、16h分别取6只小鼠取血后活杀,用烘干法测定肺组织湿/干质量(W/D)比值;光镜下观察肺组织病理学改变;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清SST、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-10)的含量;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹试验(Westem Blot)检测肺组织Toll样受体4(TLR4)和核转录因子-κBp65(NF-κBp65)的mRNA及蛋白表达.结果 对照组与SST对照组小鼠各指标比较差异均无统计学意义.与对照组比较,模型组肺组织W/D比值,血清SST、TNF-α、IL-6、IL-10水平,肺组织TLR4、NF-κBp65的mRNA及蛋白表达均明显升高,其中W/D比值、IL-6、IL-10及TLR4的mRNA和蛋白表达均于16h达峰值[W/D比值:6.32±0.18比4.14±0.14,IL-6(ng/L):673.78±56.13比50.17±7.06,IL-10(ng/L):481.13±40.78比61.71±10.05,TLR4 mRNA:0.740±0.099比0.183±0.021,TLR4蛋白:0.935±0.067比0.222±0.019,均P< 0.05],SST、TNF-α及NF-κBp65的mRNA和蛋白表达均于8h达峰值[SST(ng/L):254.97±38.75比95.87±13.95,TNF-α(ng/L):139.69±19.06比21.90±4.52,NF-κBp65 mRNA:0.753±0.065比0.208±0.029,NF-κBp65蛋白:1.214±0.079比0.303±0.067,均P<0.05].与模型组比较,SST干预组小鼠肺组织损伤程度明显减轻,除血清SST呈持续增加趋势外,其余指标均明显降低[16 h W/D比值:5.21±0.14比6.32±0.18,8 h TNF-α(ng/L):80.48±8.52比139.69±19.06,16 h IL-6(ng/L):394.99±37.17比673.78 ±56.13,16 h IL-10(ng/L):326.95±36.41比481.13±40.78,16 hTLR4 mRNA:0.240±0.028比0.740±0.099,16 h TLR4蛋白:0.618±0.066比0.935±0.067,8 h NF-κBp65mRNA:0.240±0.045比0.753±0.065,8 h NF-κBp65蛋白:0.784±0.041比1.214±0.079,均P<0.05].结论 SST干预后对内毒素诱导的ALI小鼠炎症因子释放及组织因子基因、蛋白表达均起到明显的抑制作用;其机制可能是通过阻断TLR4-NF-κB信号通路,从而减轻肺组织炎症反应.

目的:研究亚低温对脂多糖(LPS)吸入导致的急性肺损伤(ALI)大鼠Toll样受体2/髓样分化因子88(TLR2/MyD88)通路中TLR2、MyD88、核转录因子-κBp65(NF-κBp65)及相关炎性蛋白纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达的影响.方法将90只雄性SD大鼠按随机数字表法分成对照组(n=18)、亚低温组(n=24)、控温组(n=24)、非控温组(n=24).用气管内滴入LPS 0.5 mL/kg方法建立ALI模型,对照组滴入等量生理盐水;1 h后取颈动脉血并予以物理降温,亚低温组、控温组分别控制肛温在32~34℃、36~37℃,对照组、非控温组体温不加干预.分别于制模前、制模后1 h及干预后1、6、12 h进行血气分析;分别于干预后1、6、12 h处死大鼠,光镜下观察肺组织病理改变并进行半定量评分;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中PAI-1蛋白表达;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织TLR2 mRNA、MyD88 mRNA表达;蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测肺组织NF-κBp65蛋白表达.结果滴入LPS后,各组氧合指数(PaO2/FiO2)明显降低,肺组织损伤加重,肺损伤评分、BALF中PAI-1、肺组织TLR2 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κBp65蛋白表达均明显升高.给予亚低温治疗后各指标均明显改善,亚低温疗程持续6 h时效果最好,持续6~12 h可能获益.与控温组比较,亚低温组PaO2/FiO2(mmHg,1 mmHg=0.133 kPa)于干预后1 h、6 h明显升高(1 h:402.49±38.61比324.36±28.93,6 h:349.72±98.20比284.35±13.68,均P<0.01);肺损伤评分(分)于干预后1、6、12 h明显降低(1 h:6.04±0.74比7.96±0.65,6 h:9.09±0.80比13.13±1.02,12 h:10.79±1.42比13.42±0.68,均P<0.01);BALF中PAI-1蛋白表达(ng/L)于干预后1、6、12 h明显下降(1 h:121.36±4.62比197.74±9.42,6 h:230.53±10.76比294.06±16.60,12 h:270.48±13.20比319.40±10.24,均P<0.01?

目的 以缺氧/再复氧(H/R)和脂多糖(LPS)刺激人结肠上皮细胞株(FHC)模拟体内肠上皮细胞遭受缺血、缺血/再灌注和炎症打击的病理过程,探讨大黄素干预的可能作用靶点.方法 常氧组:在37 ℃下用95%空气和5%CO2培养.缺氧(H)组:于37℃下用1%O2、5%CO2和94%N2的混合厌氧气体使细胞缺氧1、2、3、4h.H+LPS组:在H组基础上给予LPS 1 mg/L刺激.H/R组:于缺氧3h后分别复氧1、2、3、4h.H/R+LPS组:在H/R基础上给予LPS 1 mg/L刺激.大黄素干预组:在H3 h/R2 h+LPS基础上给予20、40、60、80 μmol/L大黄素进行干预.用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测磷酸化核转录因子-κB(NF-κB)抑制蛋白-α(pIκB-α)、磷酸化NF-κBp65(pNF-κBp65)、环氧化酶-2(COX-2)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白表达.相差显微镜下观察各组肠上皮细胞的形态学改变;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测大黄素对肠上皮细胞增殖情况的影响.结果 ①H组:pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2表达量均于H1 h达峰值,分别为0.350±0.018、1.083±0.054、0.903±0.045,然后递减(F值分别为3.011、7.247、5.754,P值分别为0.013、0.000、0.005);HIF-1α在H3 h表达最高(1.511±0.076),但各时间点间比较无差异(F=1.881,P=0.062).H+LPS组:pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α表达量均随缺氧时间延长而增加,H3 h达峰值,分别为0.504±0.025、1.255±0.063、0.812±0.041、1.209±0.075(F值分别为2.683、8.774、9.765、2.432,P值分别为0.011、0.000、0.000、0.026).H/R组:随着再复氧时间延长,pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2表达递减,于H3 h/R4 h降至最低,分别为0.712±0.034、1.202±0.048、0.691±0.042(F值分别为1.923、6.765、2.719,P值分别为0.063、0.000、0.016);与H组相比,H/R组HIF-1α在再复氧过程中表达明显减少,但各时间点间无差异(F=1.280,P=0.081).H/R+LPS组:随着再复氧时间延长,pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α并无降解,于R2~3 h达峰值,分别为3.302±0.061、2.315±0.055、2.017±0.043、2.413±0.098(F值分别为4.614、1.652、5.970、2.076,P值分别为0.001、0.067、0.000、0.037).大黄素共同干预组:大黄素可以抑制NF-κB和HIF-1α通路蛋白表达,存在量效关系(P<0.05或P<0.01).80 μmol/L大黄素可使pIκB-α、pNF-κBp65、COX-2、HIF-1α蛋白表达量降至最低,分别为2.599±0.130、1.772±0.089、2.590±0.129、2.518±0.125;大黄素后处理细胞则无此效果.②经过H/R+LPS处理的细胞内发生空泡样变、形态改变、细胞融合,相比H组生长速度缓慢.③MTT法检测结果显示,20~ 80 μmol/L大黄素对细胞增殖无明显影响,说明大黄素在此浓度范围不仅产生了生物学效应,且对细胞无药物毒性.结论 缺氧或炎症均可激活HIF-1α的缺氧通路和NF-κB的炎症通路,在H/R过程中,这两条通路蛋白随着再复氧时间延长表达降低,但在H/R+LPS过程中蛋白仍相对高表达,缺血/再灌注损伤可能与内毒素共同作用破坏肠上皮细胞,导致肠源性脓毒症的发生.在炎症早期阶段而非晚期阶段,用大黄素可以阻断NF-κB/HIF-1 α-COX-2信号通路,从而发挥抗炎作用.

目的:观察Toll样受体2/核转录因子-κB(TLR2/NF-κB)信号通路预处理在呼吸机相关性肺损伤(VILI)中的作用。方法将30只雄性SD大鼠按随机数字表法分为3组,每组10只。A组:经气管导管缓慢滴入10μg/kg TLR2单克隆抗体(TLR2-mAb)200μL干预后,40 mL/kg潮气量(VT)行机械通气;B组:8 mL/kg VT行机械通气;C组:滴入10μg/kg无生物学活性的TLR2-mAb作为同型抗体干预后,40 mL/kg VT行机械通气。于通气4h计算肺湿/干质量(W/D)比值,镜下观察肺组织病理学及细胞超微结构改变;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织TLR2、NF-κB及髓样分化因子88(MyD88)的mRNA表达。结果显微镜下观察显示:A、B组肺组织无明显病理学改变,肺泡巨噬细胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞超微结构无明显损伤;C组可见明显肺泡腔融合,肺间隔增宽,大量炎性细胞聚集,肺泡巨噬细胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞胞膜破坏,胞质大量空泡化,细胞器破坏严重,细胞核固缩,核周隙明显增宽。A、B组肺W/D比值以及血清和BALF中炎症细胞因子水平均较C组明显降低〔肺W/D比值:1.151±0.026、1.128±0.048比1.403±0.062;血清IL-1β(ng/L):37.05±5.61、34.52±4.31比51.45±8.18,IL-6(ng/L):53.65±5.16、55.77±5.62比89.96±7.08,TNF-α(ng/L):71.93±13.29、67.36±11.42比96.20±11.60;BALF中 IL-1β(ng/L):56.48±6.16、54.44±7.26比99.77±8.41,IL-6(ng/L):172.44±21.26、163.47±18.70比216.22±23.90,TNF-α(ng/L):235.81±42.75、231.72±40.38比374.85±69.61,均P<0.01〕,而A组与B组上述指标差异均无统计学意义(均P>0.05)。A、B组肺组织TLR2、MyD88和NF-κB的mRNA表达均明显低于C组〔TLR2 mRNA(2-ΔΔCt):1.021±0.287、0.938±0.196比3.862±0.871,MyD88 mRNA(2-ΔΔCt):1.235±0.277、1.300±0.306比3.618±1.107,NF-κB mRNA(2-ΔΔCt):0.519±0.036、1.043±0.170比20.280±9.466,P<0.05或P<0.01〕,而A组与B组上述因子基因表达差异均无计学意义(均P>0.05)。结论 TLR2-mAb预处理通过阻断TLR2/NF-κB信号通路可减轻VILI模型大鼠炎症细胞因子的释放,在一定程度上减轻VILI。

目的:观察转录因子Sp3对β-catenin启动子转录活性的影响,探讨Sp3与Wnt/β-catenin信号通路的关系.方法:采用脂质体法将Sp1和(或)Sp3转录因子表达质粒单独/共同与β-catenin启动子(-410/-1bp)报告基因质粒瞬时转染HEK293T细胞;通过双萤光素酶报告基因实验检测报告基因转录活性的变化.结果:(1)Sp1表达质粒在0.4μg剂量时能提高启动子的活性2.4倍,Sp3表达质粒在0.4μg剂量时能显著提高启动子的活性5.3倍.(2)0.4μg总量的Sp1与Sp3表达质粒共转染293T细胞,随着Sp3/Sp1比例的递增,β-catenin启动子转录活性无明显变化.(3)共同转染Sp1 0.3μg与Sp3 0.1μg时,启动子活性提高3.5倍,比单独转染的转录活性强.结论:Sp3能促进β-catenin基因启动子(-410/-1 bp)的转录,Sp1的转录激活作用则较弱;在转录过程中Sp1和Sp3可能存在协同作用;Sp3可能在转录水平调控β-catenin的表达从而影响Wnt/β-catenin信号通路.

目的:构建含NADPH氧化酶1(NOX1)近端启动子区的pGL3萤光素酶报告基因载体及缺失NF-κB结合元件的相应载体,分别测定其相应活性,探讨NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子区转录活性的影响.方法:采用PCR法克隆NOX1启动子区序列(1 415 bp),将目的片段与pGL3萤光素酶载体分别双酶切、纯化后进行连接(pGL3-NOX1-1415),测序鉴定;应用Alibaba 2.1软件分析NOX1近端启动子区,获取NF-κB结合元件;重叠PCR法将含该元件的启动子区域(88 bp)缺失,并构建相应载体(pGL3-NOX1-1327).将两载体分别与pRL-TK内参质粒瞬时转染进入A549细胞,采用TNF-α(10μg/L)刺激细胞24 h,萤光酶标仪检测A549细胞的萤光素酶活性.结果:测序鉴定结果提示pGL3-NOX1-1415及NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327载体构建成功;细胞实验显示,TNF-α刺激后,转染pGL3-NOX1-1415的A549细胞萤光素酶活性明显强于对照组(P<0.05),而转染NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327的细胞萤光素酶活性明显低于转染pGL3-NOX1-1415组(P<0.05).结论:TNF-α诱导A549细胞NOX1基因活化与NF-κB密切相关,NF-κB参与了TNF-α诱导的NOX1基因启动子的转录调控.

心血管疾病是目前世界上死亡的首要原因之一,其分子机制未明.核因子κB(NF-κB)在心血管疾病中发挥着重要作用,参与免疫反应、炎症、细胞生存、分化和增殖等一系列生命活动,并影响许多心血管疾病的发生、发展,如动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭等.现就NF-κB在心血管疾病中的作用予以综述.

机体的生长发育离不开细胞内基因表达的调控.基因表达调控的关键是转录因子结合到特定的DNA序列,并随后调控基因的转录.有大量的转录因子使用一个保守的锌指结构域结合自己的目标DNA片段.三重基序蛋白(tripartite motif,TRIM)家族都具有相同的结构域,即N-末端的RING-Bbox-coiled-coil(RBCC)基因序列、bromo结构域、保守中心序列区以及C-末端的PHD指状结构域,此外该家族还都具有一个可变的C-末端,因此TRIM家族也称为RBCC家族.自从1991年