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真核表达载体pIRES2-ZsGreenl-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达
α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义.本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreenl-opLA,将其转染至猪(Sus scrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人仪一LA的细胞.根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2一ZsGreenl真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2一ZsGreenl-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了plRES2-ZsGreenl-opLA和pIRES2一ZsGreenl空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到.本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreenl-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞.李艳玲,王颖,党文庆,郝柱,徐宁迎,张金枝 - 农业生物技术学报文章来源： 万方数据 -
绵羊肺炎支原体标准株Y98外膜蛋白MOP30基因真核表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达
以绵羊肺炎支原体(Mycoplasma oumvipneoniae,MO)标准株Y98基因组为模板,设计1对特异引物,PCR扩增得到798bp的P30目的基因(MOP30),将其定向克隆到pMD19-T Simple载体中进行测序分析.重组质粒进行XbaⅠ/BamHⅠ双酶切并回收目的片段,将目的基因亚克隆入黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)表达载体pCAMBIA1300-YFP中构建重组融合表达质粒pCAMBIA1300-MOP30-YFP.双酶切验证后的融合表达质粒转化农杆菌(Agrobacterium)感受态细胞,侵染烟草(tobacco)叶片.通过激光共聚焦成像显微镜(cofocal imagingmicroscope)观察到融合表达的黄色荧光蛋白,Western-blotting试验得到57 000的特异条带,RT-PCR检测到MOP30基因在烟草叶片中转录.MOP30-YFP融合蛋白在烟草中的成功表达,为转基因植物疫苗防治绵羊支原体肺炎奠定了基础.张亚宁,赵利峰,张乐祎,赵宝华 - 中国兽医学报文章来源： 万方数据 -
真武汤对链脲佐菌素所致大鼠糖尿病肾病的保护作用
目的:探讨真武汤对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及机制。方法:腹腔注射链脲佐菌素( STZ)建立糖尿病肾病大鼠模型,将成模大鼠随机分为糖尿病肾病( DN)模型组和真武汤治疗组(真武组),另设正常组。采用生化、HE染色观察真武汤对糖尿病肾病大鼠肾功能、肾组织形态学变化及脂质过氧化相关参数的作用;采用蛋白免疫印迹方法探讨真武汤对肾组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和NF-κB表达的影响。结果:模型组大鼠肾系数、24 h尿蛋白定量、血尿素氮、肌酐、血糖和丙二醛(MDA)均显著升高(P<0.05),体重、超氧化物歧化酶(SOD)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)显著降低(P<0.05);真武组大鼠的肾系数、24 h尿蛋白、尿素氮、肌酐、血糖和MDA明显低于模型组(P<0.05),iNOS显著高于模型组(P<0.05);模型组大鼠肾小球肥大、毛细血管基底膜增厚,系膜基质增生,肾小管上皮细胞空泡样变,可见蛋白管型;真武组病变轻于模型组。模型大鼠肾组织α-SMA及NF-κB蛋白的水平明显高于正常组(P<0.05),真武组大鼠肾组织α-SMA及NF-κB蛋白水平明显低于模型组(P<0.05)。结论:真武汤能减轻糖尿病肾病肾脏局部氧化应激反应,改善糖尿病肾病大鼠肾功能,减轻病理损伤,其发挥肾脏保护作用可能与抑制α-SMA及NF-κB蛋白的表达有关。徐中菊,张悦,舒适,张瑞义 - 中国病理生理杂志文章来源： 万方数据 -
非物质文化空间数据库与地图表达方法-基于蔚县剪纸的实证研究
本文提出了"文化景观→文化载体→空间数据库→载体联合→文化景观"的非物质文化空间数据库与地图化表达模式,为开展系统性文化地理研究奠定基础.蔚县剪纸的实证研究中,通过解析蔚县剪纸文化景观,建立了包括艺人、生产作坊、文化受众、网络店铺等10种文化载体的空间数据库;通过不同的文化载体整合实现艺人分布空间、艺人行为空间、艺术风格空间、艺术传承空间和产销空间等地图表达成果.地图表达为进一步开展景观格局特征及其驱动机制的挖掘分析奠定了基础.本文是针对文化地理研究方法论的探讨和实证,通过文化景观的抽象语言描述到地图可视化表达,为非物质文化现象的时空研究提供了新模式.李仁杰,傅学庆,张军海 - 人文地理文章来源： 万方数据 -
猪甲状腺激素应答基因SPOTl4(THRSP)的原核表达及其融合蛋白的亲和纯化
甲状腺激素应答基因(thyroid hormone responsive SPOTl4,THR5P)是受甲状腺激素诱导表达的核内基因,参与脂肪合成代谢途径限速酶的转录调控,对动物脂肪生成具有重要的调控作用.为进一步研究猪SPOTl4基因所编码蛋白质的生物学功能,本实验将猪SPOTl4(GenBank登录号:JF951726)的ORF片段与表达载体pET一280ff+)进行重组,获得的重组子pET一280ff+).S14,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)感受态细胞,重组菌经IPTG诱导,通过SDS.PAGE分析显示,目的蛋白分子量约为20.91kD,且主要以包涵体形式存在,最佳诱导条件是37℃1mmol/LIPTG诱导5h.将获得的包涵体用6xHisNi-NTA纯化柱纯化后,采用Westemblot进一步检测到了21kD目的蛋白的表达.重组质粒pET.280L(+)一S14在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地得到了表达,不仅为SPOTl4基因生物学功能的研究,而且为进一步研究S14蛋白功能,了解脂肪代谢调控机制提供了基础资料.王丛梅,郭豫杰,李宏基,韩立强,李奎,杨国宇 - 农业生物技术学报文章来源： 万方数据 -
人LMP-1基因腺病毒蚕组体的构建及其在骨肉瘤细胞U20S中的表达
目的:构建表达人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)细胞系U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达.方法:以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对LMP-1进行扩增,通过TA克隆与pGEM-T载体连接并DNA测序.双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和DNA测序鉴定,并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达.线性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒Ad-LMP-1.通过脂质体介导,在HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1,大量扩增、纯化并测定滴度.用Ad-LMP-1感染OS细胞系U2OS,通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测LMP-1在U2OS细胞中的表达.结果:双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功,荧光显微镜证实转染了pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组.通过扩增、纯化,Ad-LMP-1滴度达到1.5*109pfu/ml.荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的U2OS内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot检测发现重组腺病毒感染U2OS后,LMP-1的mRNA和蛋白表达量明显高于对照组.结论:成功构建了人LMP-1基因腺病毒重组体,为进一步的实验研究奠定了基础.刘会文,黄路,韩智敏,罗嘉全,杨东,詹平,戴闽,曹凯 - 重庆医科大学学报文章来源： 万方数据 -
弓形虫分泌蛋白ROP2的原核重组表达与免疫反应性鉴定
本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2 (ROP2),并初步评价其免疫反应性.主要步骤为体外细胞培养速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP2基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM (DE3) pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His-ROP2,最后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性.本研究获得了ROP2全长重组蛋白,初步证明其良好的免疫反应性,为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法,研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础.薛峰,黄敏君,洪彩玲,杨英超,甘绍伯,谷俊朝 - 寄生虫与医学昆虫学报文章来源： 万方数据 -
庄子真的反对儒家仁义吗?--兼驳李硬《广废庄论》
晚唐儒者李硬的《广废庄论》对庄子的"虚无"、"天命"、"因任"及"性情"思想提出批评,理路清晰、严谨.但其对"虚无"、"天命"、"性情"的批评没有切中《庄子》要害,在概念厘清上尚有欠缺;对"因任"的批评最值得深入探讨,因为其要害在于庄子是否真的反仁义而倡因任.本文从庄子的问题意识和仁义观出发给予回应,指出庄子反对的是伪仁义,倡导以"真"保证"仁义"的本质,对"仁义"被利用而变"伪"的现象进行纠偏.这一思路与原始儒家重"真"贵"情"的精神实际上并不违背.林光华 - 人文杂志文章来源： 万方数据 -
放射性束物理实验发展现状
近年来随着放射性束流装置的发展,对非稳定核的研究取得了一系列的重大进展.重要的物理发现包括滴线区的晕核与增强的集团结构、非稳定核中的壳演化与新幻数、新的有效相互作用、新的集体运动模式、核反应中的多步过程与强耦合效应等.本文着重从实验探测的角度,对非稳定核基态基本物理量的测量、非稳定核的衰变测量、中低能核反应、快速束流及零度谱学等方面做了概述和分析,特别指出他们在非稳定核研究中作用和新发展.李阔昂,叶沿林 - 核技术文章来源： 万方数据
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