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pEGFP-N1-H2B1重组质粒的构建和鉴定
母胎免疫耐受作为天然的同种异体免疫耐受模型,大量研究表明,位于母胎界面的绒毛膜组织不表达经典人类白细胞抗原(HLA)Ⅰa类分子而表达非经典HLAⅠb分子(包括HLA-G等)是母胎耐受的重要机制之一.小鼠的H2B1(blastocyst MHC)基因具有HLA-G结构,其mRNA选择性表达于母胎界面,被认为是HLA-G的同源基因,研究表明blastocyst MHC以H2B1mRNA的形式能有效减栗一帆,梁志伟,姜惠敏 - 山西医药杂志文章来源： 万方数据 -
DP1/02株鸭源Ⅰ型副黏病毒F基因真核质粒构建及免疫试验
应用RT-PCR方法从鸭源Ⅰ型副黏病毒DP1/02株中扩增F基因并克隆入pMD18-T载体,经序列测定、分析,DP1/02株F基因与鸡新城疫病毒(NDV)国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到99%.随后将F基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-F,将阳性质粒体外转染Vero细胞,通过间接免疫荧光对真核质粒的表达进行鉴定,利用pCI-F质粒进行动物试验.结果表明构建的真核表达质粒pCI-F能够在Vero细胞中表达,雏鸭免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,二次免疫雏鸭后,对NDV强毒的攻毒保护率为73%.本试验为利用F基因构建的核酸疫苗提供了重要的技术支持.张秀峰,王中华,刘佳旭,刘艳华,母连志,李国江,丁壮 - 中国兽医学报文章来源： 万方数据 -
人Midkine基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
目的:构建人Midkine( MK)基因RNA干扰( RNA interference, RNAi)慢病毒载体并鉴定,为其体内外实验研究提供基础。方法设计针对人MK基因序列的4条RNAi靶点序列,分别与慢病毒载体进行连接,获得GV115-MK-1、GV115-MK-2、GV115-MK-3和GV115-MK-4质粒,转染感受态细菌,经PCR及测序技术的鉴定,然后与pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。4种病毒载体感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞后,用RT-PCR检测MK mRNA的表达。结果 PCR和测序检测结果证实,插入的MK RNAi核苷酸序列正确,共转染293T细胞后可见大量绿色荧光。浓缩病毒后测定其滴度分别为6×108、5×108、5×108和6×108 TU/ml。感染 MDA-MB-231细胞后, RT-PCR 检测结果表明, GV115-MK-1干扰效果明显,MK基因敲减效率达87.2%( P<0.05)。结论成功构建人MK RNAi慢病毒表达载体,并可有效抑制MDA-MB-231细胞MK基因的表达。王庆苓,张鹏 - 临床与实验病理学杂志文章来源： 万方数据 -
CIK细胞在荷瘤鼠体内的肿瘤靶向性与安全性
目的:探讨CIK细胞对肿瘤组织的靶向性及其在荷瘤鼠体内的运行轨迹和对主要脏器的影响。方法分离制备人CIK细胞,采用体外Transwell迁移试验观察CIK细胞对人乳腺癌细胞MDA-MB-435的靶向迁移效应;以该细胞系接种BALB/c裸鼠建立乳腺癌移植瘤模型,尾静脉注射DiI标记的CIK细胞,应用活体成像和病理学检查观察CIK细胞运行轨迹及对主要脏器的影响。结果 CIK细胞在体外培养14~20天时,细胞增殖达到高峰,CD3+CD56+ T细胞的比例也达到最高值。体外Tr-answell迁移实验显示,随着肿瘤细胞上清液浓度的增加,CIK细胞的迁移数量也随之增多。荷瘤裸鼠尾静脉注射DiI标记的CIK细胞后,活体成像显示肿瘤组织24 h开始出现荧光信号,48 h达到最强;HE和免疫组化染色结果显示,注射后6 h肿瘤周围开始聚集CIK细胞,48 h最多,第14天时肿瘤部位仍有CIK细胞存在,各脏器均未发现由CIK细胞导致的病理组织学损伤。结论 CIK细胞在体内外对肿瘤组织均具有靶向性,对正常组织有安全性,可作为一种有潜力的细胞载体应用于肿瘤的靶向治疗。刘霞,胡奇婵,王涛,黄睿,崔静,王丽,杨举伦 - 临床与实验病理学杂志文章来源： 万方数据 -
中心组合设计法优化载基因壳聚糖纳米粒的最佳转染制备区域
目的采用中心组合设计法优化载基因壳聚糖纳米粒的最佳转染制备区域.方法采用复凝聚法制备载质粒基因的壳聚糖纳米粒,选择壳聚糖浓度和质粒基因浓度作为实验考察因素,应用两因素五水平中心组合设计优化最佳转染制备区域,优化指标选择平均粒径和基因转染率.通过透射电镜观察纳米粒的形态;通过动态光散射和电泳光散射技术分别测量纳米粒的粒径和Zeta电位;通过凝胶电泳分析考察质粒在纳米粒制备过程中的稳定性;通过倒置荧光显微镜观察质粒基因在细胞内的表达;通过流式细胞技术测定纳米粒的转染效率.结果成功优化了载基因壳聚糖纳米粒的最佳转染制备区域.优选条件下制备的纳米粒大多呈球形,纳米粒平均粒径为217.6 nm,粒径多分散系数为0.241,表明粒径分布较窄.纳米粒zeta电位为+22.4 m V,表明纳米粒表面带有正电荷,可以增加纳米粒混悬液的稳定性.凝胶电泳分析结果表明质粒基因在纳米粒制备过程中没有遭到破坏.纳米粒的细胞转染效率比较高,能够高效地将绿色荧光蛋白质粒基因递送到细胞内,并且基因表达产生绿色荧光蛋白.结论本研究建立的数学模型具有良好的预测性.在优化的制备区域内制备的载基因壳聚糖纳米粒的转染性能比较理想.邵帅,崔光华,周旭,高钟镐,黄伟 - 药学实践杂志文章来源： 万方数据 -
微博:高校思政教育的去仪式化载体
微博在大学生中迅速普及,成为他们展示自我和学习交流的重要载体.微博云聚粉丝,汇集人气,成为学校与师生、校友、家长以及社会各界信息交流、思想沟通和资讯互动的平台.但是,从微博对大学生思想政治教育构成的挑战性看,微博未必温暖.教育者应该因势利导,积极利用微博短、平、快以及无屏障性等特点编织温暖的围脖,实现思想政治教育从封闭教室到网络空间的去仪式化转变,收到随微博之风潜入夜,润学生思想细无声的效果.屈小燕 - 西南民族大学学报(人文社会科学版)文章来源： 万方数据 -
人类mtDNA D-Loop区位点变异对基因表达的影响
Case-Control研究表明,人线粒体基因(mtDNA) D-Loop区mt235、mt514-515、mt16183、mt16290和mt16319多态位点与有氧运动能力有关.拟从下游基因表达做进一步的研究,以探讨上述多态位点的分子调控机理.方法:采用全基因组合成法合成包含上述多态位点的DNA序列,分别连接到pGL3-promoter载体构建重组质粒,将重组质粒转染至293T细胞,观察携带5对mtDNA质粒对下游双荧光素酶报告基因的表达及荧光素酶mR-NA表达的影响.结果:携带mt235A、mt514-515CA、mt16183A和mt16319G的载体转染细胞的双荧光素酶基因表达量显著高于mt235G、mt514-515Del、mt16183C和mt16319A(P<0.01);携带mt16290两种基因型的质粒转染细胞报告基因表达没有明显差异.与pGL3-promoter载体相比,携带mt16319A的质粒转染细胞荧光素酶mRNA极显著下降(P<0.01),携带mt16290位点的两种质粒对报告基因mRNA的影响没有差异.结论:mt235、mt514-515、mt16183和mt16319多态位点影响荧光素酶基因表达,mt235A、mt514-515CA和mt16183A上调基因转录和翻译,mt16319A下调基因转录.这些基因表达上的差异可能是影响人有氧运动能力的重要调控因素.龚丽景,胡扬,李燕春,梅涛 - 体育科学文章来源： 万方数据 -
5型腺病毒载体对人T淋巴细胞的转染及细胞毒性分析
目的:利用5型腺病毒载体转染人T淋巴细胞,对其转染T淋巴细胞的效率以及细胞毒性进行分析.方法:选取T淋巴瘤Jurkat细胞及原代T细胞,腺病毒按感染复数(multiplicity of infection,MOI)为20、50、100、200和400对其转染,转染48 h后利用流式细胞术检测转染效率;选取腺病毒转染后的不同时点,利用碘化丙啶染色法分析转染对于细胞周期的影响;利用Annexin V/7-AAD染色法分析转染诱导细胞凋亡情况;利用台盼蓝染色计数法分析转染对活细胞数目的影响.结果:5型腺病毒载体转染T淋巴瘤的效率最高,转染效率随着MOI值的增大而增加;CD8+T细胞和CD4+T细胞的转染效率大致相同,T细胞经刺激活化后,CD8+T细胞的转染效率下降;病毒转染未导致明显细胞凋亡;病毒转染对细胞周期与活细胞数目没有显著影响.结论:5型腺病毒载体转染T细胞呈现较低细胞毒性.张文峰,张琼宇,邵红伟,吴凤麟,王腾,黄树林 - 中国病理生理杂志文章来源： 万方数据 -
靶向ER-α36的vshRNA真核表达慢病毒载体的构建、鉴定及其对胃癌细胞增殖的影响
目的:针对雌激素受体( ER)-α36基因的特异性靶序列,构建并鉴定靶向ER-α36基因RNAi慢病毒载体,研究ER-α36沉默后对胃癌细胞增殖的影响。方法:筛选确定的ER-α36基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与慢病毒载体(GV307)连接,测序鉴定。转染293T细胞,包装产生慢病毒,感染胃癌SGC7901细胞株。荧光显微镜下观察SGC7901感染后荧光表达情况,real-time PCR和Western blotting方法检测ER-α36的表达变化。用1×10-10 mol/L的17β-雌二醇处理沉默ER-α36的SGC7901细胞,用细胞计数法观察细胞增殖能力的变化及检测相关下游信号通路分子Src、ERK1/2、cyclin D1表达的变化。结果:阳性克隆PCR及测序证明成功构建慢病毒载体LV-ER-α36-RNAi,倒置显微镜下观察LV-ER-α36-RNAi慢病毒载体感染率达80%以上。 Real-time PCR和Western blotting方法证实四环素( TeT)诱导下LV-ER-α36-RNAi明显抑制SGC7901细胞内ER-α36 mRNA和蛋白质的表达。与对照组相比,沉默ER-α36的SGC7901细胞增殖能力减弱,Src、ERK1/2、cyclin D1蛋白表达明显降低,Src蛋白活化能力减弱( P<0.05)。结论:我们构建的TeT诱导靶向ER-α36的vshRNA慢病毒载体LV-ER-α36-RNAi,可明显沉默ER-α36的表达,为研究ER-α36蛋白的作用机理提供实验依据,ER-α36与胃癌细胞等肿瘤细胞的增殖有关。王绪明,黄萱,付政祺,邹丰,张尚昆,王兆一,刘丽江 - 中国病理生理杂志文章来源： 万方数据 -
人LMP-1基因腺病毒蚕组体的构建及其在骨肉瘤细胞U20S中的表达
目的:构建表达人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)细胞系U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达.方法:以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对LMP-1进行扩增,通过TA克隆与pGEM-T载体连接并DNA测序.双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和DNA测序鉴定,并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达.线性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒Ad-LMP-1.通过脂质体介导,在HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1,大量扩增、纯化并测定滴度.用Ad-LMP-1感染OS细胞系U2OS,通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测LMP-1在U2OS细胞中的表达.结果:双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功,荧光显微镜证实转染了pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组.通过扩增、纯化,Ad-LMP-1滴度达到1.5*109pfu/ml.荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的U2OS内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot检测发现重组腺病毒感染U2OS后,LMP-1的mRNA和蛋白表达量明显高于对照组.结论:成功构建了人LMP-1基因腺病毒重组体,为进一步的实验研究奠定了基础.刘会文,黄路,韩智敏,罗嘉全,杨东,詹平,戴闽,曹凯 - 重庆医科大学学报文章来源： 万方数据
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