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人Midkine基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
目的:构建人Midkine( MK)基因RNA干扰( RNA interference, RNAi)慢病毒载体并鉴定,为其体内外实验研究提供基础。方法设计针对人MK基因序列的4条RNAi靶点序列,分别与慢病毒载体进行连接,获得GV115-MK-1、GV115-MK-2、GV115-MK-3和GV115-MK-4质粒,转染感受态细菌,经PCR及测序技术的鉴定,然后与pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。4种病毒载体感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞后,用RT-PCR检测MK mRNA的表达。结果 PCR和测序检测结果证实,插入的MK RNAi核苷酸序列正确,共转染293T细胞后可见大量绿色荧光。浓缩病毒后测定其滴度分别为6×108、5×108、5×108和6×108 TU/ml。感染 MDA-MB-231细胞后, RT-PCR 检测结果表明, GV115-MK-1干扰效果明显,MK基因敲减效率达87.2%( P<0.05)。结论成功构建人MK RNAi慢病毒表达载体,并可有效抑制MDA-MB-231细胞MK基因的表达。王庆苓,张鹏 - 临床与实验病理学杂志文章来源： 万方数据 -
蛋白激酶 Cε对肝癌 SK-H ep-1细胞生物学行为的影响
目的:使用小干扰RNA( siRNA)抑制人肝癌SK-Hep-1细胞中蛋白激酶Cε( PKCε)的表达并对抑制效果进行测定,检测沉默后SK-Hep-1细胞增殖和侵袭能力的变化。方法:培养SK-Hep-1细胞,分为PKCε-siR-NA组、阴性对照(NC-siRNA)组和未行处理(control)组。采用MTT比色法观察各组细胞增殖能力的变化,采用Tr-answell法观察各组细胞侵袭能力的变化,Western blotting观察细胞核增殖抗原Ki67、基质金属蛋白酶9( MMP-9)等功能蛋白的表达,萤光素酶报告基因检测NF-κB信号通路的活性。结果:与对照组相比, PKCε-siRNA组PKCεmRNA和蛋白表达水平都明显降低(P<0.01),Ki67和MMP-9蛋白表达水平降低,细胞增殖能力明显降低(P<0.01),PKCε-siRNA组穿过Transwell膜的细胞少于对照组(P<0.01),且NF-κB转录活性下降(P<0.01)。结论:通过siRNA技术降低PKCε表达可抑制肝癌SK-Hep-1细胞增殖及其侵袭能力,其抑制作用可能与抑制NF-κB通路的转录活性有关。- 中国病理生理杂志文章来源： 万方数据 -
人胰腺癌 PANC-1细胞裸鼠移植瘤模型建立及其用于观察载 siRNA 纳米微粒体内效应的研究
目的:探讨建立人胰腺癌PANC-1裸鼠移植瘤模型的最佳实验方法,并应用该模型进行载基因纳米微粒体内效应的研究。方法:将不同数量PANC-1细胞悬液接种于BALB/c (nu/nu)小鼠右侧背部皮下,当肿瘤体积达100 mm 3时尾静脉注射siRNACY 5.5纳米复合物进行活体荧光成像。此外,于尾静脉注射负载siRNA Kras纳米复合物,蛋白印迹及免疫组织化学染色法观察肿瘤组织Kras蛋白表达水平。结果:1×107 cells/300μL 接种成瘤率达100%,成瘤时间<2周。荧光呈像及组织学检查显示载siRNA纳米微粒可靶向聚集在肿瘤组织发挥体内基因沉默效应。结论:本研究报道的人胰腺癌裸鼠移植瘤模型建立方法成瘤率达100%,成瘤时间短,是研究药物示踪和观察疗效的理想模型。曾林涓,李景果,张秋波,钱辰琛,林忠,陈茵婷,黄开红 - 中国病理生理杂志文章来源： 万方数据 -
慢病毒载体介导的RNA干扰及其在T淋巴细胞的应用
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是普遍存在于生物体中的一种序列特异性的基因表达调控方式,它是由小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)介导的特异性降解mRNA的过程[1].T淋巴细胞是处于非分裂期的细胞,在移植物抗宿主病等疾病中起到重要作用,是基因治疗中常用的靶细胞.但在RNAi技术中,T淋巴细胞基因转导效率低而影杜晶晶,孙轶华 - 中国病理生理杂志文章来源： 万方数据 -
RNA干扰技术沉默CDC25a基因对人肝癌细胞HepG2增殖的影响
目的:研究细胞分裂周期素25a( cell division cycle 25a,CDC25a)基因沉默后对于人肝癌细胞系HepG2增殖的影响。同时探讨该影响发生的可能作用机制。方法:使用RNA干扰技术沉默人肝癌HepG2细胞的CDC25a基因,采用实时荧光定量PCR技术检测肝癌细胞中的CDC25a及其作用基因cyclin E及CDK2的mRNA表达水平,Western blotting检测CDC25a的蛋白表达水平,并采用MTT法、Giemsa染色法及流式细胞技术检测细胞的增殖情况。结果:CDC25a的mRNA及蛋白表达水平在RNA沉默组细胞中的表达低于阴性对照组及正常对照组细胞(P<0.05)。 Cyclin E及CDK2的mRNA表达水平在沉默组低于阴性对照及正常对照组(P<0.05)。 MTT法、Giemsa染色法结果显示沉默组细胞增殖能力低于阴性对照组及正常对照组细胞( P<0.05),流式细胞技术结果显示沉默组细胞阻滞在G1期。结论:LV-CDC25a-RNAi重组体感染HepG2细胞可以有效抑制CDC25a基因的表达,使人肝癌HepG2细胞增殖受到抑制,提示CDC25a基因可能是肝癌治疗的关键靶点。李薇,曹骥,周玲丽,罗旺,杨春,骆成飘,李瑗,苏建家 - 中国病理生理杂志文章来源： 万方数据 -
干扰 ID H-2基因对小细胞肺癌生长抑制作用的研究
目的:研究siRNA特异干扰沉默异柠檬酸脱氢酶2(IDH-2)基因后对人小细胞肺癌细胞NCI-H446生长作用的影响。方法:用siRNA沉默NCI-H446细胞的IDH-2基因表达,用real-time PCR及Western blotting技术检测mRNA-IDH-2和蛋白的表达;CCK-8法测定细胞生长抑制,Western blotting 检测MAPK p42的表达和流式细胞术检测细胞周期;用Transwell细胞迁移系统检测siRNA-IDH-2对NCI-H446细胞迁移能力的影响;将转染siRNA-IDH-2、阴性对照siRNA的细胞或未转染细胞皮下接种于 BALB/c 裸鼠背部,观察移植瘤的生长状况。结果:siRNA-IDH-2有效沉默NCI-H446细胞中IDH-2的表达;与对照组相比,下调IDH-2基因表达抑制NCI-H446细胞的增殖;MAPK p42蛋白表达下降且S期细胞明显增加;下调IDH-2基因显著抑制了NCI-H446细胞的迁移能力;体内实验显示siRNA-IDH-2组的肿瘤体积明显小于对照组。结论: siRNA-IDH-2能显著抑制IDH-2基因在人小细胞肺癌细胞NCI-H446中的表达,并降低细胞迁移效率,在体外和体内明显抑制NCI-H446细胞的生长。陆建红,陈国军,董长林,郭绍文,金益军 - 中国病理生理杂志文章来源： 万方数据 -
RNA干扰技术的研究及进展
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引发的转录后基因静默机制.RNAi具有高效、稳定、特异性强等特点.RNAi为基因和蛋白质学等的研究提供了新的技术和方法,RNAi被发现10年来,在基础研究和临床研究领域已经得到了长足的发展,并且已经初步显示出其巨大的潜力.现主要对介导siRNA方法及RNAi技术在抗肿瘤、抗病毒、功能基因组学、药物筛选和遗传疾病研究等领域中的最新研究进展综述.张小芳,李守霞 - 医学综述文章来源： 万方数据 -
针对MAG,OMgp,NogoA基因的scFv(OMgp)-9R-siRNA复合物的制备和鉴定
目的 运用抗体靶向技术联合siRNA形成双特异性复合物scFv-9R-siRNA的高效递送系统,该系统通过抗OMgp的scFv把MAG,OMgp和Nogo A的特异性siRNA特异性运输至受损神经细胞,从而抑制这三种轴突抑制物的表达,改善脊髓损伤后的局部微环境,阻断这些髓磷脂相关抑制物对轴突再生的抑制作用,为后续的大鼠模型试验奠定基础.方法 (1)根据基因重组技术,利用制备好的高效抗OMgp单克隆抗体构建单链抗体scFv(OMgp),并在此基础上非共价合成针对MAG,OMgp,NogoA基因的scFv (OMgp)-9R-siRNA复合物;(2)体外鉴定scFv (OMgp)-9R-siRNA复合物效果:鉴定MAG,OMgp,NogoA三种抑制物的mRNA和蛋白表达水平,同时与非神经细胞对比,研究引入scFv后所产生的靶细胞特异性.结果 (1)成功制备抗大鼠OMgp单克隆抗体E811,并通过ELISA和Western blot对已制备的抗大鼠OMgp单克隆抗体E811进行了特异性和敏感性鉴定,在此基础上成功获得scFv (OMgp)-9R-siRNA复合物;(2)体外实验证实:scFv (OMgp)-9R-siRNA复合物同时特异性下调MAG,OMgp和Nogo A基因表达.结论 单链抗体技术(scFv)解决了siRNA的特异性导入受损神经元问题,为体内应用siRNA技术治疗脊髓损伤奠定了基础.马建国,严望军,刘铁龙,肖建如,周许辉,贾连顺 - 实验动物与比较医学文章来源： 万方数据 -
RNA干扰靶向抑制自噬调控基因Beclin 1对结肠癌细胞株HCT116自噬活性及增殖/凋亡的影响
目的 应用RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术抑制自噬调控基因Beclin 1的表达,检测Beclin 1表达对mTOR、ULK1、LC3-B的表达以及对HCT116细胞株增殖与凋亡的影响.方法 设计4条针对Beclin 1基因的干扰RNA表达载体及阴性对照载体分别瞬时转染HCT116细胞.采用RT-PCR及Western blot法筛选出1条抑制率最高的Beclin 1干扰序列后,瞬时转染HCT116细胞,检测mTOR、ULK1及LC3-B的mRNA及蛋白表达,CCK-8实验检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果(1)转染细胞后,BECN1-1245组mRNA及蛋白抑制率最高,达80%.(2)RT-PCR结果显示,BECN1-1245组转染细胞48 h后,与阴性对照组相比,ULK1与LC3-B mRNA表达水平降低,差异有统计学意义(P≤0.05),mTOR在两组中的表达无差异(P〉0.05),Western blot法检测结果与之相同.(3)CCK-8细胞增殖实验显示,BECN1-1245组转染24、48、72 h后,细胞生存率较阴性对照组明显降低(P≤0.05).(4)流式细胞仪检测结果显示,BECN1-1245组转染48 h后,与阴性对照组细胞相比,细胞凋亡率明显升高(P≤0.05).结论 Beclin 1在HCT116细胞自噬中发挥重要的调控作用,抑制Beclin 1的表达,可抑制细胞的自噬活性,并能抑制细胞增殖,促进其凋亡,推测Beclin 1基因可作为结肠癌治疗的新靶点.吴淑华,何双,胡金龙,温菲菲,孙晨博,田东 - 临床与实验病理学杂志文章来源： 万方数据 -
siRNA干扰缺氧诱导因子-2α对乳腺癌细胞增殖能力的影响
目的 探讨缺氧诱导因子-2α(hypoxia-inducible factors-2α,HIF-2α)siRNA对乳腺癌细胞MCF-7增殖能力的影响及相关机制.方法 采用CoCl2处理细胞,建立细胞缺氧模型,应用RNA干扰技术沉默MCF-7细胞中HIF-2α的表达;运用RT-PCR技术检测转染后MCF-7细胞中HIF-2α mRNA的表达;绘制细胞生长曲线,观察细胞生长速度和倍增时间;通过流式细胞术观察细胞周期分布的改变;采用RT-PCR技术检测增殖相关基因的表达.结果 细胞缺氧模型建立成功.RNA干扰结果显示:缺氧+siRNA组HIF-2α mRNA的表达与单纯缺氧组相比明显降低(P<0.05);细胞生长曲线结果显示:缺氧+siRNA组与单纯缺氧组相比,细胞生长速度明显减慢,倍增时间显著延长(P均<0.05);细胞周期结果显示:缺氧+siRNA组与单纯缺氧组相比,S期和G2/M期细胞比例显著减少(P<0.05);RT-PCR结果显示:缺氧+siRNA组与单纯缺氧组相比,p21基因表达上调(P<0.05),Cyclin B基因表达下调(P<0.05).结论 HIF-2α siRNA可抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖能力,可能与p21基因表达上调、Cyclin B基因表达下调有关.李娜,王洪兴,张洁,李永真,千新来 - 临床与实验病理学杂志文章来源： 万方数据
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