搜索 - 科创中国

人Midkine基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人Midkine( MK)基因RNA干扰( RNA interference, RNAi)慢病毒载体并鉴定,为其体内外实验研究提供基础。方法设计针对人MK基因序列的4条RNAi靶点序列,分别与慢病毒载体进行连接,获得GV115-MK-1、GV115-MK-2、GV115-MK-3和GV115-MK-4质粒,转染感受态细菌,经PCR及测序技术的鉴定,然后与pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。4种病毒载体感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞后,用RT-PCR检测MK mRNA的表达。结果 PCR和测序检测结果证实,插入的MK RNAi核苷酸序列正确,共转染293T细胞后可见大量绿色荧光。浓缩病毒后测定其滴度分别为6×108、5×108、5×108和6×108 TU/ml。感染 MDA-MB-231细胞后, RT-PCR 检测结果表明, GV115-MK-1干扰效果明显,MK基因敲减效率达87.2%( P<0.05)。结论成功构建人MK RNAi慢病毒表达载体,并可有效抑制MDA-MB-231细胞MK基因的表达。

王庆苓,张鹏 - 临床与实验病理学杂志

文章来源：万方数据

靶向ER-α36的vshRNA真核表达慢病毒载体的构建、鉴定及其对胃癌细胞增殖的影响

目的:针对雌激素受体( ER)-α36基因的特异性靶序列,构建并鉴定靶向ER-α36基因RNAi慢病毒载体,研究ER-α36沉默后对胃癌细胞增殖的影响。方法:筛选确定的ER-α36基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与慢病毒载体(GV307)连接,测序鉴定。转染293T细胞,包装产生慢病毒,感染胃癌SGC7901细胞株。荧光显微镜下观察SGC7901感染后荧光表达情况,real-time PCR和Western blotting方法检测ER-α36的表达变化。用1×10-10 mol/L的17β-雌二醇处理沉默ER-α36的SGC7901细胞,用细胞计数法观察细胞增殖能力的变化及检测相关下游信号通路分子Src、ERK1/2、cyclin D1表达的变化。结果:阳性克隆PCR及测序证明成功构建慢病毒载体LV-ER-α36-RNAi,倒置显微镜下观察LV-ER-α36-RNAi慢病毒载体感染率达80%以上。 Real-time PCR和Western blotting方法证实四环素( TeT)诱导下LV-ER-α36-RNAi明显抑制SGC7901细胞内ER-α36 mRNA和蛋白质的表达。与对照组相比,沉默ER-α36的SGC7901细胞增殖能力减弱,Src、ERK1/2、cyclin D1蛋白表达明显降低,Src蛋白活化能力减弱( P<0.05)。结论:我们构建的TeT诱导靶向ER-α36的vshRNA慢病毒载体LV-ER-α36-RNAi,可明显沉默ER-α36的表达,为研究ER-α36蛋白的作用机理提供实验依据,ER-α36与胃癌细胞等肿瘤细胞的增殖有关。

王绪明,黄萱,付政祺,邹丰,张尚昆,王兆一,刘丽江 - 中国病理生理杂志

文章来源：万方数据

慢病毒载体介导的RNA干扰及其在T淋巴细胞的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是普遍存在于生物体中的一种序列特异性的基因表达调控方式,它是由小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)介导的特异性降解mRNA的过程[1].T淋巴细胞是处于非分裂期的细胞,在移植物抗宿主病等疾病中起到重要作用,是基因治疗中常用的靶细胞.但在RNAi技术中,T淋巴细胞基因转导效率低而影

杜晶晶,孙轶华 - 中国病理生理杂志

文章来源：万方数据

5型腺病毒载体对人T淋巴细胞的转染及细胞毒性分析

目的:利用5型腺病毒载体转染人T淋巴细胞,对其转染T淋巴细胞的效率以及细胞毒性进行分析.方法:选取T淋巴瘤Jurkat细胞及原代T细胞,腺病毒按感染复数(multiplicity of infection,MOI)为20、50、100、200和400对其转染,转染48 h后利用流式细胞术检测转染效率;选取腺病毒转染后的不同时点,利用碘化丙啶染色法分析转染对于细胞周期的影响;利用Annexin V/7-AAD染色法分析转染诱导细胞凋亡情况;利用台盼蓝染色计数法分析转染对活细胞数目的影响.结果:5型腺病毒载体转染T淋巴瘤的效率最高,转染效率随着MOI值的增大而增加;CD8+T细胞和CD4+T细胞的转染效率大致相同,T细胞经刺激活化后,CD8+T细胞的转染效率下降;病毒转染未导致明显细胞凋亡;病毒转染对细胞周期与活细胞数目没有显著影响.结论:5型腺病毒载体转染T细胞呈现较低细胞毒性.

张文峰,张琼宇,邵红伟,吴凤麟,王腾,黄树林 - 中国病理生理杂志

文章来源：万方数据

微小RNA传递载体聚乙二醇-b-聚赖氨酸的合成及细胞毒性研究

目的:制备微小RNA( miRNA)传递载体聚乙二醇-b-聚赖氨酸( PEG-b-PLL),并且选用模型细胞对其进行毒性考察。方法通过核磁谱测定聚赖氨酸的聚合度,用4%琼脂糖凝胶电泳检测聚复合物对miRNA的包封,用动态光散射法测定制备所得聚复合物粒径、多分散性指数(PDI),Zeta电位,用荧光标记的FAM-hsa-miR-15a进行包封率的测定,采用CKK-8试剂盒测定K562细胞(人慢性淋巴白血病细胞)活力考察PEG-b-PLL的细胞毒性。结果用PEG-b-PLL制备的聚阳离子胶束/miRNA复合物特性符合应用要求,并且细胞毒性显著低于聚乙烯亚胺( PEI ), lipo2000。结论离子聚合物载体PEG-b-PLL符合应用要求,同时毒性较低,有望成为基因转染的有效载体。

任海峰,赵英魁,杨峰,俞媛,马志强 - 药学实践杂志

文章来源：万方数据

Ag85B慢病毒抑制人支气管上皮细胞TSLP及其受体的表达

目的:研究结核分枝杆菌抗原85B(Ag85B)慢病毒对正常人支气管上皮细胞(NHBEC)表达胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)和其受体TSLPR的影响,探究Ag85B抑制哮喘气道炎症的机制.方法:将Ag85B基因重组质粒转入293T细胞,构建携带Ag85B和EGFP报告基因的慢病毒载体p LVXIRES-Neo-EGFP-Ag85B(Ag85B慢病毒).用鉴定后的Ag85B慢病毒感染HEK293细胞,计算滴度并观察感染效率.利用Lipofectamine? 2000使Ag85B慢病毒感染体外培养NHBEC,设立空病毒感染和空白对照组.Real-time PCR和Western blotting检测Ag85B、TSLP和TSLPR mRNA和蛋白表达水平.结果:成功构建Ag85B慢病毒感染NHBEC体系,Ag85B慢病毒感染NHBEC 48 h后,荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白表达,细胞生长状态良好,病毒滴度为2*1011TU/L,感染效率达到90%以上.Real-time PCR和Western blotting结果显示Ag85B慢病毒成功感染NHBEC,可见相应Ag85B mRNA和蛋白表达.与空病毒感染和空白对照组比较,Ag85B慢病毒感染组TSLP mRNA表达有下降趋势,TSLPR mRNA与TSLP和TSLPR的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05).结论:Ag85B慢病毒感染NHBEC可以抑制NHBEC的TSLP和TSLPR的表达,提示Ag85B可能通过靶向阻滞TSLP-TSLPR途径抑制哮喘气道炎症.

房祥峰,钱江,孟锦绣,李东风,吴健 - 中国病理生理杂志

文章来源：万方数据

慢病毒介导的 CCN1基因对大鼠骨髓间充质干细胞生长和迁移的影响

目的:探讨外源性CCN1对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)生长和迁移的作用。方法:构建带有绿色荧光蛋白的大鼠CCN1慢病毒载体(Lenti-GFP-CCN1)并感染大鼠BMSCs,筛选最适感染复数(MOI);实验分为空白组、感染Lenti-GFP组和感染Lenti-GFP-CCN1组,倒置荧光显微镜下观察BMSCs感染后荧光表达情况;MTT法检测细胞存活率,划痕愈合实验检测细胞迁移作用。结果:与空白组和阴性对照组相比,Lenti-GFP-CCN1感染大鼠BMSCs后,细胞的存活率未见明显差异;感染组细胞划痕愈合实验的愈合宽度/原宽度值与空白组及阴性对照组相比差异显著(P<0.05)。结论:外源性CCN1对正常大鼠BMSCs存活率无影响,可促进BMSCs迁移。

孙湛,巩雪俐,冉新建,马琪,龙梅 - 中国病理生理杂志

文章来源：万方数据

基线MELD、MELD-Na、iMELD 3种模型对乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭患者近期预后的评估价值

目的探讨基线终末期肝病模型(MELD)、MELD-Na、整合MELD模型(iMELD)3种模型评估初始治疗乙型肝炎病毒(HBV)相关慢加急性肝衰竭(ACLF)患者近期预后的价值.方法对解放军第三○二医院2011年1月至2013年1月收治的232例初始治疗的HBV相关ACLF患者进行前瞻性临床随访,分析患者入院时MELD、MELD-Na、iMELD与12周时临床转归的关系,评判3种模型对患者近期预后的预测价值.结果最终191例患者完成12周临床随访,完成率为82.33%;死亡85例,病死率为44.50%.与存活组比较,死亡组基线MELD(分:26.65±7.75比21.19±5.42,t=-5.720,P=0.000)、MELD-Na(分:29.16±11.35比21.72±6.33,t=-5.729,P=0.000)、iMELD(分:47.19±10.96比38.02±7.01,t=-7.011,P=0.000)、总胆红素[TBil(μmol/L):374.3±150.1比305.5±147.1,t=-3.182,P=0.002]、肌酐[Cr(μmol/L):110.7±90.1比71.1±35.1,t=-4.157,P=0.000]、国际标准化比值(INR:2.3±0.9比2.0±0.6,t=-2.754,P=0.006)均明显升高,血清Na+水平(mmol/L:132.8±6.1比136.7±5.1,t=4.861,P=0.000)明显降低.Spearman相关分析显示,基线MELD、MELD-Na、iMELD与患者近期预后均呈显著正相关(r值分别为0.398、0.404、0.470,均P=0.000),基线血清Na+水平与患者近期预后呈显著负相关(r=-0.365,P=0.000).受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析显示,基线MELD、MELD-Na、iMELD 3种模型的临界值分别为25.07、25.43、43.11分,ROC曲线下面积(AUC)分别为0.731、0.735、0.773,敏感度分别为55.3%、57.7%、63.5%,特异度分别为84.9%、84.0%、84.9%,3种模型的预测价值均无差异.3种模型根据各自的临界值将患者分为4组,病死率整体均存在差异(MELD的x2=34.740,P=0.000;MELD-Na的x2=36.861,P=0.000; iMELD的x2=50.127,P=0.000),且随3种模型分值增加,患者病死率均呈逐渐上升趋势.结论基线MELD、MELD-Na、iMELD均能较好地预测初始治疗HBV相关ACLF患者的近期预后,对指导治疗有较好的临床价值.

李晨,游绍莉,刘鸿凌,刘婉姝,万志红,唐国,辛绍杰 - 中华危重病急救医学

文章来源：万方数据

慢病毒介导的 RASSF1A 表达抑制小细胞肺癌 H446细胞的生长

目的:探讨Ras相关结构域家族1A (Ras-association domain family 1A, RASSF1A)抑制小细胞肺癌细胞生长的机制。方法:构建含有RASSF1A基因的慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒,感染H446小细胞肺癌细胞。 MTT测细胞生长曲线;流式细胞术测细胞周期;real-time PCR和Western blotting分别检测细胞周期相关蛋白mRNA和蛋白水平的表达。结果:成功获取稳定表达RASSF1A的H446细胞(RASSF1A-H446)。 RASSF1A-H446细胞生长缓慢,细胞周期阻滞在G1期。 Real-time PCR和Western blotting 结果显示在RASSF1A-H446细胞中,p21和p27的表达明显升高,E2F1的表达明显降低。结论: RASSF1A通过升高p21、p27和降低E2F1的表达,抑制H446细胞的生长。

孔丽君,张立霞,栾希英,张丽沙,王绪菡,于恒运,张月芝 - 中国病理生理杂志

文章来源：万方数据

人LMP-1基因腺病毒蚕组体的构建及其在骨肉瘤细胞U20S中的表达

目的:构建表达人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)细胞系U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达.方法:以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对LMP-1进行扩增,通过TA克隆与pGEM-T载体连接并DNA测序.双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和DNA测序鉴定,并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达.线性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒Ad-LMP-1.通过脂质体介导,在HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1,大量扩增、纯化并测定滴度.用Ad-LMP-1感染OS细胞系U2OS,通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测LMP-1在U2OS细胞中的表达.结果:双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功,荧光显微镜证实转染了pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组.通过扩增、纯化,Ad-LMP-1滴度达到1.5*109pfu/ml.荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的U2OS内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot检测发现重组腺病毒感染U2OS后,LMP-1的mRNA和蛋白表达量明显高于对照组.结论:成功构建了人LMP-1基因腺病毒重组体,为进一步的实验研究奠定了基础.

刘会文,黄路,韩智敏,罗嘉全,杨东,詹平,戴闽,曹凯 - 重庆医科大学学报

文章来源：万方数据