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CIK细胞在荷瘤鼠体内的肿瘤靶向性与安全性
目的:探讨CIK细胞对肿瘤组织的靶向性及其在荷瘤鼠体内的运行轨迹和对主要脏器的影响。方法分离制备人CIK细胞,采用体外Transwell迁移试验观察CIK细胞对人乳腺癌细胞MDA-MB-435的靶向迁移效应;以该细胞系接种BALB/c裸鼠建立乳腺癌移植瘤模型,尾静脉注射DiI标记的CIK细胞,应用活体成像和病理学检查观察CIK细胞运行轨迹及对主要脏器的影响。结果 CIK细胞在体外培养14~20天时,细胞增殖达到高峰,CD3+CD56+ T细胞的比例也达到最高值。体外Tr-answell迁移实验显示,随着肿瘤细胞上清液浓度的增加,CIK细胞的迁移数量也随之增多。荷瘤裸鼠尾静脉注射DiI标记的CIK细胞后,活体成像显示肿瘤组织24 h开始出现荧光信号,48 h达到最强;HE和免疫组化染色结果显示,注射后6 h肿瘤周围开始聚集CIK细胞,48 h最多,第14天时肿瘤部位仍有CIK细胞存在,各脏器均未发现由CIK细胞导致的病理组织学损伤。结论 CIK细胞在体内外对肿瘤组织均具有靶向性,对正常组织有安全性,可作为一种有潜力的细胞载体应用于肿瘤的靶向治疗。刘霞,胡奇婵,王涛,黄睿,崔静,王丽,杨举伦 - 临床与实验病理学杂志文章来源： 万方数据 -
5型腺病毒载体对人T淋巴细胞的转染及细胞毒性分析
目的:利用5型腺病毒载体转染人T淋巴细胞,对其转染T淋巴细胞的效率以及细胞毒性进行分析.方法:选取T淋巴瘤Jurkat细胞及原代T细胞,腺病毒按感染复数(multiplicity of infection,MOI)为20、50、100、200和400对其转染,转染48 h后利用流式细胞术检测转染效率;选取腺病毒转染后的不同时点,利用碘化丙啶染色法分析转染对于细胞周期的影响;利用Annexin V/7-AAD染色法分析转染诱导细胞凋亡情况;利用台盼蓝染色计数法分析转染对活细胞数目的影响.结果:5型腺病毒载体转染T淋巴瘤的效率最高,转染效率随着MOI值的增大而增加;CD8+T细胞和CD4+T细胞的转染效率大致相同,T细胞经刺激活化后,CD8+T细胞的转染效率下降;病毒转染未导致明显细胞凋亡;病毒转染对细胞周期与活细胞数目没有显著影响.结论:5型腺病毒载体转染T细胞呈现较低细胞毒性.张文峰,张琼宇,邵红伟,吴凤麟,王腾,黄树林 - 中国病理生理杂志文章来源： 万方数据 -
靶向ER-α36的vshRNA真核表达慢病毒载体的构建、鉴定及其对胃癌细胞增殖的影响
目的:针对雌激素受体( ER)-α36基因的特异性靶序列,构建并鉴定靶向ER-α36基因RNAi慢病毒载体,研究ER-α36沉默后对胃癌细胞增殖的影响。方法:筛选确定的ER-α36基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与慢病毒载体(GV307)连接,测序鉴定。转染293T细胞,包装产生慢病毒,感染胃癌SGC7901细胞株。荧光显微镜下观察SGC7901感染后荧光表达情况,real-time PCR和Western blotting方法检测ER-α36的表达变化。用1×10-10 mol/L的17β-雌二醇处理沉默ER-α36的SGC7901细胞,用细胞计数法观察细胞增殖能力的变化及检测相关下游信号通路分子Src、ERK1/2、cyclin D1表达的变化。结果:阳性克隆PCR及测序证明成功构建慢病毒载体LV-ER-α36-RNAi,倒置显微镜下观察LV-ER-α36-RNAi慢病毒载体感染率达80%以上。 Real-time PCR和Western blotting方法证实四环素( TeT)诱导下LV-ER-α36-RNAi明显抑制SGC7901细胞内ER-α36 mRNA和蛋白质的表达。与对照组相比,沉默ER-α36的SGC7901细胞增殖能力减弱,Src、ERK1/2、cyclin D1蛋白表达明显降低,Src蛋白活化能力减弱( P<0.05)。结论:我们构建的TeT诱导靶向ER-α36的vshRNA慢病毒载体LV-ER-α36-RNAi,可明显沉默ER-α36的表达,为研究ER-α36蛋白的作用机理提供实验依据,ER-α36与胃癌细胞等肿瘤细胞的增殖有关。王绪明,黄萱,付政祺,邹丰,张尚昆,王兆一,刘丽江 - 中国病理生理杂志文章来源： 万方数据 -
微小RNA传递载体聚乙二醇-b-聚赖氨酸的合成及细胞毒性研究
目的:制备微小RNA( miRNA)传递载体聚乙二醇-b-聚赖氨酸( PEG-b-PLL),并且选用模型细胞对其进行毒性考察。方法通过核磁谱测定聚赖氨酸的聚合度,用4%琼脂糖凝胶电泳检测聚复合物对miRNA的包封,用动态光散射法测定制备所得聚复合物粒径、多分散性指数(PDI),Zeta电位,用荧光标记的FAM-hsa-miR-15a进行包封率的测定,采用CKK-8试剂盒测定K562细胞(人慢性淋巴白血病细胞)活力考察PEG-b-PLL的细胞毒性。结果用PEG-b-PLL制备的聚阳离子胶束/miRNA复合物特性符合应用要求,并且细胞毒性显著低于聚乙烯亚胺( PEI ), lipo2000。结论离子聚合物载体PEG-b-PLL符合应用要求,同时毒性较低,有望成为基因转染的有效载体。任海峰,赵英魁,杨峰,俞媛,马志强 - 药学实践杂志文章来源： 万方数据 -
人LMP-1基因腺病毒蚕组体的构建及其在骨肉瘤细胞U20S中的表达
目的:构建表达人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)细胞系U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达.方法:以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对LMP-1进行扩增,通过TA克隆与pGEM-T载体连接并DNA测序.双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和DNA测序鉴定,并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达.线性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒Ad-LMP-1.通过脂质体介导,在HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1,大量扩增、纯化并测定滴度.用Ad-LMP-1感染OS细胞系U2OS,通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测LMP-1在U2OS细胞中的表达.结果:双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功,荧光显微镜证实转染了pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组.通过扩增、纯化,Ad-LMP-1滴度达到1.5*109pfu/ml.荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的U2OS内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot检测发现重组腺病毒感染U2OS后,LMP-1的mRNA和蛋白表达量明显高于对照组.结论:成功构建了人LMP-1基因腺病毒重组体,为进一步的实验研究奠定了基础.刘会文,黄路,韩智敏,罗嘉全,杨东,詹平,戴闽,曹凯 - 重庆医科大学学报文章来源： 万方数据 -
人Midkine基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
目的:构建人Midkine( MK)基因RNA干扰( RNA interference, RNAi)慢病毒载体并鉴定,为其体内外实验研究提供基础。方法设计针对人MK基因序列的4条RNAi靶点序列,分别与慢病毒载体进行连接,获得GV115-MK-1、GV115-MK-2、GV115-MK-3和GV115-MK-4质粒,转染感受态细菌,经PCR及测序技术的鉴定,然后与pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。4种病毒载体感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞后,用RT-PCR检测MK mRNA的表达。结果 PCR和测序检测结果证实,插入的MK RNAi核苷酸序列正确,共转染293T细胞后可见大量绿色荧光。浓缩病毒后测定其滴度分别为6×108、5×108、5×108和6×108 TU/ml。感染 MDA-MB-231细胞后, RT-PCR 检测结果表明, GV115-MK-1干扰效果明显,MK基因敲减效率达87.2%( P<0.05)。结论成功构建人MK RNAi慢病毒表达载体,并可有效抑制MDA-MB-231细胞MK基因的表达。王庆苓,张鹏 - 临床与实验病理学杂志文章来源： 万方数据 -
Ag85B慢病毒抑制人支气管上皮细胞TSLP及其受体的表达
目的:研究结核分枝杆菌抗原85B(Ag85B)慢病毒对正常人支气管上皮细胞(NHBEC)表达胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)和其受体TSLPR的影响,探究Ag85B抑制哮喘气道炎症的机制.方法:将Ag85B基因重组质粒转入293T细胞,构建携带Ag85B和EGFP报告基因的慢病毒载体p LVXIRES-Neo-EGFP-Ag85B(Ag85B慢病毒).用鉴定后的Ag85B慢病毒感染HEK293细胞,计算滴度并观察感染效率.利用Lipofectamine? 2000使Ag85B慢病毒感染体外培养NHBEC,设立空病毒感染和空白对照组.Real-time PCR和Western blotting检测Ag85B、TSLP和TSLPR mRNA和蛋白表达水平.结果:成功构建Ag85B慢病毒感染NHBEC体系,Ag85B慢病毒感染NHBEC 48 h后,荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白表达,细胞生长状态良好,病毒滴度为2*1011TU/L,感染效率达到90%以上.Real-time PCR和Western blotting结果显示Ag85B慢病毒成功感染NHBEC,可见相应Ag85B mRNA和蛋白表达.与空病毒感染和空白对照组比较,Ag85B慢病毒感染组TSLP mRNA表达有下降趋势,TSLPR mRNA与TSLP和TSLPR的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05).结论:Ag85B慢病毒感染NHBEC可以抑制NHBEC的TSLP和TSLPR的表达,提示Ag85B可能通过靶向阻滞TSLP-TSLPR途径抑制哮喘气道炎症.房祥峰,钱江,孟锦绣,李东风,吴健 - 中国病理生理杂志文章来源： 万方数据 -
真核表达载体pIRES2-ZsGreenl-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达
α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义.本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreenl-opLA,将其转染至猪(Sus scrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人仪一LA的细胞.根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2一ZsGreenl真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2一ZsGreenl-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了plRES2-ZsGreenl-opLA和pIRES2一ZsGreenl空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到.本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreenl-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞.李艳玲,王颖,党文庆,郝柱,徐宁迎,张金枝 - 农业生物技术学报文章来源： 万方数据 -
微博:高校思政教育的去仪式化载体
微博在大学生中迅速普及,成为他们展示自我和学习交流的重要载体.微博云聚粉丝,汇集人气,成为学校与师生、校友、家长以及社会各界信息交流、思想沟通和资讯互动的平台.但是,从微博对大学生思想政治教育构成的挑战性看,微博未必温暖.教育者应该因势利导,积极利用微博短、平、快以及无屏障性等特点编织温暖的围脖,实现思想政治教育从封闭教室到网络空间的去仪式化转变,收到随微博之风潜入夜,润学生思想细无声的效果.屈小燕 - 西南民族大学学报(人文社会科学版)文章来源： 万方数据 -
pEGFP-N1-H2B1重组质粒的构建和鉴定
母胎免疫耐受作为天然的同种异体免疫耐受模型,大量研究表明,位于母胎界面的绒毛膜组织不表达经典人类白细胞抗原(HLA)Ⅰa类分子而表达非经典HLAⅠb分子(包括HLA-G等)是母胎耐受的重要机制之一.小鼠的H2B1(blastocyst MHC)基因具有HLA-G结构,其mRNA选择性表达于母胎界面,被认为是HLA-G的同源基因,研究表明blastocyst MHC以H2B1mRNA的形式能有效减栗一帆,梁志伟,姜惠敏 - 山西医药杂志文章来源： 万方数据
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